doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.06.038
·论著/临床免疫学·
类风湿关节炎患者外周血CD45−CD31−PDPN+细胞比例与炎症指标和自身抗体的关系研究①
陈淑惠何毓珏汤纪丰江仁权俞子晴夏锦芳林锦骠（福建医科大学附属第一医院检验科，福建医科大学基因诊断研究中心，福建省检验医学重点实验室，福州 350005）
中图分类号R593.22 文献标志码  A 文章编号1000-484X（2023）06-1290-05
［摘要］目的：探讨类风湿关节炎（RA）患者外周血CD45−CD31−PDPN+细胞与红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）、类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体）、IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的关系。方法：选取福建医科大学附属第一医院56例RA患者和63例健康体检者。根据实验室正常参考范围将ESR、CRP、RF、抗CCP抗体与4种细胞因子的检测结果分为阴性组与阳性组，比较外周血中CD45−CD31−PDPN+细胞的比例与4种细胞因子、ESR、CRP、RF和抗CCP抗体的关系。采用Mann-Whitney U检验、t检验、χ2检验对指标进行组间比较，CD45−CD31−PDPN+细胞的比例与年龄的相关性采用Pearson 相关性分析。结果：RA患者的CD45−CD31−PDPN+细胞的比例低于健康体检者（P<0.05）；抗CCP抗体阳性组的细胞比例高于阴性组（P=0.001）；CRP阳性组的
细胞比例低于阴性组（P<0.05）；TNF-α阳性组的细胞比例低于阴性组（P<0.05）。结论：RA患者外周血CD45−CD31−PDPN+细胞比例与抗CCP抗体、CRP和TNF-α有关。
［关键词］类风湿关节炎；CD45−CD31−PDPN+细胞；炎症指标；C-反应蛋白
Research on relationship between CD45−CD31−PDPN+cells ratio and inflam-matory indexes and autoantibodies in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis
CHEN Shuhui， HE Yujue， TANG Jifeng， JIANG Renquan， YU Ziqing， XIA Jinfang， LIN Jinpiao. Department of Laboratory Medicine，Gene Diagnosis Research Center，Fujian Key Laboratory of Laboratory Medicine，the First Affiliated Hospital， Fujian Medical University， Fuzhou 350005， China
［Abstract］Objective：To investigate the relationships between CD45−CD31−PDPN+cells and erythrocyte sedimentation rate （ESR）， C-reactive protein （CRP）， rheumatoid factors （RF）， autoantibodies against citrullinated antigens （anti-CCP）， IL-1β， IL-6，TNF-α， IFN-γ in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis （RA）. Methods：A total of 56 patients with RA and 63 healthy controls were included from the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University. According to the normal laboratory reference range， the test results of ESR， CRP， RF， anti-CCP
antibody and 4 kinds of cytokines were divided into negative group and positive group， respectively. The relationships between the proportion of CD45−CD31−PDPN+ cell population in peripheral blood and 4 kinds of cytokines， ESR， CRP， RF and anti-CCP antibody were compared. Indexes were compared between groups by Mann-Whitney U test，t test orχ2test，and the correlation between CD45−CD31−PDPN+cells ratio and age were analyzed by Pearson correlation analysis. Results：The percentage of CD45−CD31−PDPN+ cells in RA patients was lower than that in healthy adults （P<0.05）； the ratio of the cells in anti-CCP positive group was higher than that in negative group （P=0.001）； CD45−CD31−PDPN+ cells ratio in CRP positive group was lower than negative （P<0.05）， the same as TNF-α. Conclusion：CD45−CD31−PDPN+cells ratio is related to anti-CCP， CRP and TNF-α in peripheral blood of patients with RA.
［Key words］Rheumatoid arthritis；CD45−CD31−PDPN+ cells；Inflammatory biomarkers；C-reactive protein
①本文为国家自然科学基金项目（82072356，81871710）。
作者简介：陈淑惠，女，在读硕士，主要从事类风湿关节炎研究，E-mail：chensh2020@fjmu.edu。
通信作者及指导教师：林锦骠，男，医学博士，副主任技师，主要从事类风湿关节炎研究，E-mail： jinpiaolin@fjmu.edu。
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一类
病因未明的自身免疫性疾病，主要症状为引起关节
滑膜病变，软骨及骨关节损伤，甚至导致残疾［1］。当
前研究主要致力于寻RA的致病机制及实验室诊
断指标，从而实现对疾病的早期发现、和控制，
然而对引起疾病间歇性恶化的因素关注较少。美
国洛克菲勒大学ORANGE联合DARNELL团队研究
发现，RA患者中存在CD45−CD31−Podoplanin+（平足蛋白，PDPN）细胞，该细胞具有炎症滑膜成纤维
细胞特征［2］。在外周血中，该细胞的比例随着疾
病的急性发作发生改变。根据血液转录谱和纵向
基因组分析发现，RA发作前1~2周，B细胞活化后，CD45−CD31−PDPN+细胞开始扩增，并随血液循环最后定居于关节滑膜部位，促使疾病进入活动期，提示该细胞与RA活动期相关。当前并无更多研究报道CD45−CD31−PDPN+细胞与RA的关系。RA 的实验室指标通常采集患者外周血样本进行检测，常用的有类风湿因子（rheumatoid factors，RF）、抗环瓜氨酸肽抗体（autoantibodies against citrullinated an‑tigens，抗CCP抗体）、红细胞沉降率（erythrocyte sedi‑mentation rate，ESR）或C反应蛋白（C-reactive pro‑tein，CRP）。其中，RF在RA患者中的阳性检出率很高，是RA患者血清中常见的自身抗体；抗CCP抗体在疾病早期阶段就可以出现阳性。在RA诊断指南中，以ESR或CRP阳性来提示该疾病处于活动期［3］。在疾病炎症过程中，通常又伴随着多种细胞因子的水平变化。在课题组的前期研究中，已佐证多种细胞因子与RA密切相关，如TNF-α、IFN-γ、IL-6等［4-7］。CD45−CD31−PDPN+细胞在外周血扩增并随血液循环至关节滑膜局部，是否与RA患者的自身抗体和炎症水平相关？本研究通过检测RA患者外周血CD45−CD31−PDPN+细胞比例及IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平，收集RA患者及健康对照的一般资料，探究该细胞与自身抗体和炎症指标的关系。
1 资料与方法
1.1　资料　
1.1.1　研究对象　福建医科大学附属第一医院2021年3月至2021年10月住院及门诊56例RA患者，其中男性17例，女性39例，年龄27~73岁。选择63例健康人作为健康对照组，男性23例，女性40例，年龄28~73岁。入选标准：RA患者诊断符合2010年ACR/EULAR修订的分类标准。排除标准：①合并感染；②排除继发性干燥综合征外合并其他风湿免
疫病者（重叠综合征、系统性红斑狼疮、硬皮病等）。本研究经福建医科大学附属第一医院伦理委员会审核批准，批准文号：闽医大附一伦理医技审［2015］084号及闽医大附一伦理医技审［2015］084-
1号，各研究对象知情同意。
1.1.2　仪器与试剂　Navios流式细胞分析仪购自美国贝克曼；流式抗体CD45-FITC、CD31-PE、Podo‑planin-APC购自eBioscience；12项细胞因子检测试剂盒（多重微球流式免疫荧光发光法）购自青岛瑞斯凯尔生物技术有限公司；RF检测试剂盒购自美国贝克曼公司；抗CCP抗体检测试剂盒购自欧蒙公司。
1.2　方法　
1.2.1　标本采集　收集研究对象新鲜乙二胺四乙酸三钾（EDTA-3K）抗凝全血，吸取100 µl进行CD45−CD31−PDPN+细胞流式检测，3 000 r/min离心8 min，留取血浆进行细胞因子检测。
1.2.2　流式细胞术检测CD45−CD31−PDPN+细胞　向各流式管中依次加入3种流式抗体，每种抗体3 µl；取对应编号100 µl全血加入流式管中，充分与流式抗体混匀，37 ℃避光孵育30 min，溶血。溶血后，加入1 000 µl鞘流液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入400 µl鞘流液重悬细胞，流式细胞仪检测，采用FlowJo软件分析结果。
1.2.3　流式细胞术检测细胞因子　基于免疫学分析方法，采用直接夹心法检测细胞因子，所有操作均严格遵循试剂说明书。实验室正常参考范围：IL-1β≤12.4 pg/ml；IL-6≤5.4 pg/ml；IFN-γ≤23.1 pg/ml；TNF-α≤16.5 pg/ml。
1.2.4　临床及实验室检查指标收集　临床资料包括性别、年龄、起病到确诊时间、吸烟情况等。实验室指标包括RF、抗CCP抗体、ESR、CRP、红细胞计数（RBC）、红细胞分布宽度（RDW）、血小板计数（PLT）、白细胞计数（WBC）、中性粒细胞计数（NEU）、淋巴细胞计数（LYM）；ESR正常值为男性≤60岁，<21 mm/h；男性>60岁，<43 mm/h；女性≤50岁，< 26 mm/h；女性>50岁，<38 mm/h；CRP正常值<8 mg/L；RF采用免疫散射比浊法检测，以20 U/ml为阳性临界值；抗CCP抗体采用ELISA检测，以5 RU/ml为阳性临界值。
1.3　统计学处理　采用GraphPad Prism Version 8.0软件进行统计学分析，根据数据资料是否服从正态分布，采用xˉ±s或中位数（四分位数间距）表示；计数资料两组间的比较采用t检验或Mann-Whitney
U检验；计量资料的比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关分析；所有比较均为双尾，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1　一般资料　收集患者一般临床资料，RA组年龄27~73岁，平均年龄为（54.66±10.90）岁，健康对照组年龄28~73岁，平均年龄为（5
3.27±10.59）岁；
RA组和健康对照组两组间平均年龄和性别均无差异（P>0.05），见表1。
2.2　RA组和健康对照组外周血CD45−CD31−PDPN+细胞比例比较　RA组患者外周血CD45−CD31−PDPN+细胞比例低于健康对照组（P<0.05），见图1A。将RA患者分为男性组和女性组，比较其外周血CD45−CD31−PDPN+细胞比例，结果差异无统计学意义（P>0.05），见图1B。该细胞与年龄无相关性（r=−0.081 0，P=0.552 9），见图1C。
2.3　CD45−CD31−PDPN+细胞比例与RA活动期炎症指标的关系　将RA患者根据CRP结果分为阴性组和阳性组，CRP阴性组的外周血CD45−CD31−PDPN+细胞比例高于CRP阳性组，差异存在统计学意义（P<0.05），见图2A；将RA患者根据血沉结果分为阴性组和阳性组，比较其外周血CD45−CD31−
PDPN+细胞比例，差异无统计学意义（P>0.05），见图2B。2.4　CD45−CD31−PDPN+细胞比例与RA相关自身抗体指标的关系　将RA患者的RF结果以实验室正常参考范围Cut-off值分为两组，即RF阴性组（−）和RF阴性组（+），比较其外周血CD45−CD31−PDPN+细胞比例，差异无统计学意义（P>0.05），见图3A。将RA患者根据抗CCP抗体结果以5 RU/ml为界分成两组，比较其外周血CD45−CD31−PDPN+细胞比
表1　RA患者及健康对照一般临床资料
Tab.1　General clinical data of RA patients and healthy controls
Clinical data
Age/year Sex（M/F）RF/（IU·ml−1）anti-CCP/（RU·ml−1）ESR/（mm·h−1）CRP/（mg·L−1）RBC×1012/L
RDW/% PLT/109L−1 WBC/109L−1 NEU/109L−1 LYM/109L−1
RA（n=56）
54.66±10.90
17/39
94.40（36.50，290.00）
93.40（45.15，152.9）
26.50（19.25，52.00）
10.00（3.28，28.68）
4.35±0.61
13.85（13.15，15.15）
262.79±100.53
7.90±2.83
5.27±2.39
1.85±0.98
HD（n=63）
53.27±10.59
23/40
−
−
−
−
4.62±0.40
13.00（12.55，13.45）
242.86±53.86
5.85±1.29
3.35±0.98
1.91±0.44
Note：Depending on whether the parameters follow a normal distribu‑tion，data are presented as xˉ±s deviation or median （quartile range）
.Note：**.P<0.01；ns.No significance.
图3　CD45−CD31−PDPN+细胞比例与RF、抗CCP抗体的关系
Fig.3　Relationship between CD45−CD31−PDPN+cells and RF， anti-
CCP
Note：*.P<0.05；ns.No significance.
图2　外周血CD45−CD31−PDPN+细胞比例与CRP、ESR的关系
Fig.2　Relationship between CD45−CD31−PDPN+cells and CRP，
ESR in peripheral blood
Note：A.Comparison of CD45−CD31−PDPN+cells in peripheral blood between RA group and healthy control group；B.Comparison of CD45−CD31−PDPN+ cells in peripheral blood between male and fe‑male RA patients；C.Correlation analysis of peripheral blood CD45−CD31−PDPN+ cells （n/N%） and age in RA patients.n/N is the ratio of the target cell number of CD45−CD31−PDPN+ cells to the total cell number measured.*.P<0.05；ns.No significance.图1　RA组和健康对照组外周血CD45−CD31−PDPN+细胞比例比较
Fig.1　Comparison of CD45−CD31−PDPN+cells in periph⁃eral blood between RA group and healthy control
groupreactive阳性是什么
例，抗CCP 抗体阳性组（+）的细胞的比例高于阴性组（P =0.001），见图3B 。
2.5　CD45−CD31−PDPN +细胞比例与细胞因子的关系　将RA 患者外周血血浆IL -1β、IL -6、TNF -α和IFN -γ水平根据实验室正常参考范围Cut -off 值分为阴性组（−）和阳性组（+），比较其外周血CD45−CD31− PDPN +细胞比例，TNF -α组间存在统计学差异（P <0.05），其余指标组间差异无统计学意义（P >0.05），
见图4。
3 讨论
PDPN +是一个与成纤维细胞迁移和滑膜细胞分
化有关的表位，该蛋白倾向在具有侵袭和破坏软骨能力的成纤维细胞中表达，在癌细胞和癌症相关的成纤维细胞中表达上调，从而促进转移［8-10］。有研究表明PDPN 可以介导RA 滑膜细胞和血小板的相互作用，调节IL -8的产生［11］。在RA 疾病进程中，成纤维细胞样间充质细胞和免疫细胞的相互作用导致促炎细胞因子的产生，导致炎症的慢性迁延［9］。
有学者报道在RA 患者的滑膜炎症血管附近发现炎症亚系成纤维细胞，推测该细胞可能由PRIME 细胞（CD45−CD31−PDPN +）发育而来［12］。AC3基因簇富含3种亚系成纤维细胞基因（CD34+、HLA -DR +和
DKK3+），通过荧光激活细胞分选技术对CD45−CD31− PDPN +细胞RNA 序列进行分选，证实该细胞富含AC3基因簇。这细胞比例在RA 疾病恶化前出现峰值，但恶化期间在血液中不易检测到，这支持了PRIME 细胞从血液迁移到滑膜模型［2］。对于RA 患者，一般不通过对关节滑膜取材进行检测观察，
能否通过外周血预测RA 患者关节滑膜炎症情况？在该细胞迁移过程中，又是否伴随实验室指标的变化？
本研究发现，RA 患者外周血CD45−CD31−PDPN +
细胞比例低于健康对照组。该细胞具有炎症
滑膜成纤维细胞的特征，可作为炎症滑膜成纤维前体细胞参与血液循环迁移至RA 患者关节局部进一步分化从而参与疾病活动期过程。在迁移-定居-分化过程可能与多种因素相关，比如基因易感性、局
部组织损伤等导致RA 患者在疾病慢性迁移伴随间断反复发作过程中，总体细胞比例降低。
RF 和抗CCP 抗体是诊断RA 常用的实验室指
标。RF 在RA 患者中长期存在，可经过免疫抑制剂而降低。据报道，在69%RA 患者中存在RF ，对
该疾病的特异度为60%~85%［13］。值得注意的是，
RF 也可以在其他疾病状态（如感染、某些类型癌症和其他风湿性疾病）以及健康患者中检测［14］。瓜氨酸肽存在于RA 患者关节的滑膜组织中，而正常人关节则不含此肽，沉积在RA 患者关节滑膜组织上的瓜氨酸肽是其产生自身免疫应答的主要靶抗原。有研究报道，抗CCP 抗体阳性患者比抗体阴性的患者易发展更严重的关节骨质破坏［15］。CD45−CD31− PDPN +细胞最终定局至关节局部参与病变过程，抗CCP 抗体阳性组CD45−CD31−PDPN +细胞的比例高于阴性组，提示该细胞与RA 密切相关，抗CCP 抗体浓度较高，CD45−CD31−PDPN +细胞的比
例也较高。
根据先前文献报道CD45−CD31−PDPN +细胞
比例降低可预测RA 疾病的活动期［2］。本研究对提示RA 活动期的实验室指标进行了分析。ESR 和
CRP 测量反映了系统性炎症的不同方面，WOLFE ［16］报道在RA 患者中，ESR 与一些提示慢性炎症的指标测量结果（如免疫球蛋白升高、RF ）相关性更好，
而CRP 能更准确地反映炎症急性期反应。ESR 检测指标灵敏度高，易受多种因素影响，可能掩盖了其与CD45−CD31−PDPN +细胞比例波动的关系。在本研究中，发现CD45−CD31−PDPN +细胞的比例在CRP 检测结果分组存在统计学差异（P =0.043 2）。CRP 检测结果阴性时，CD45−CD31−PDPN +细胞的比例在外周血较高，而CRP 结果阳性时，该细胞的比例较低。以往的报道显示，CD45−CD31−PDPN +细胞是一类与RA 炎症状态有关的细胞，在疾病静止期该细胞在外周血的比例较多，随后经相关因素刺激分化发育，患者呈慢性炎症状态，
无明
Note ：*.P <0.05；ns.No significance.
图4　CD45−CD31−PDPN +细胞比例与IL -1β、IL -6、TNF -α、
IFN -γ的关系
Fig.4　Relationship between CD45−CD31−PDPN + cells and
IL -1β， IL -6， TNF -α， IFN -γ
显疾病活动期临床症状［2，9］；随后该细胞迁移或者促进炎症细胞迁移进入损伤的关节滑膜定居，最终分化为滑膜炎症细胞，导致大量炎症细胞活化，分泌大量炎症因子，导致疾病进入活动期。本研究又进一步探索了IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ与外周血
CD45−CD31−PDPN+细胞的比例的关系。在细胞发育和迁移过程中涉及多种细胞因子，同时IL的分泌受多种因素调控，本研究结果提示RA疾病恶化期间细胞比例降低可能与TNF-α有关。TNF-α信号通路是RA的重要靶点［17］。TNF-α与RA炎症状态密切相关，其可以通过激活NF-κB信号通路发挥促炎作用，诱导白细胞和内皮细胞的激活，细胞因子和趋化因子的级联反应［18］。在RA活动期，CD45−C
D31−PDPN+细胞大量迁移到滑膜局部，外周血该细胞的比例下降，外周血CRP和TNF-α水平高于正常参考值，CD45−CD31−PDPN+细胞可作为疾病活动度的一个判断指标。
本研究旨在探究CD45−CD31−PDPN+细胞比例与实验室检测指标的关系，但仍存在一些不足，如未对患者进行长期随访。未来可能还需要更多样本的回顾性分析研究进一步评估该细胞与实验室指标的相关性。
综上所述，在RA患者中，通过CRP组间比较佐证了先前报道CD45−CD31−PDPN+细胞的比例与炎症状态有关，并且进一步发现了该细胞与抗CCP抗体和TNF-α实验室指标关系较密切。
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［收稿 2021‑11‑09 修回 2022‑02‑25］
（编辑苗磊）

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