GPX1和SOD1在腺样囊性癌中的表达及其意义
柳叶青;李海凤;韩静静;黄志权;李海刚
【摘 要】目的 研究谷胱甘肽过氧化物酶1 (Glutathione Peroxidase,GPX1)基因和超氧化物歧化酶1(Super Oxide Dismutase,SOD1)基因在唾液腺腺样囊性癌(SACC)中的表达,探讨两者在肿瘤中的潜在联系以及它们与SACC的临床病理特征及患者预后的关系.方法 采用免疫组化法检测35例SACC和18例癌旁腺体中GPX1和SOD1的蛋白表达,分析GPX1和SOD1的表达是否存在相关性及各自与SACC临床病理特征之间的关系.采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析.结果 GPX1和SOD1在SACC肿瘤组织细胞核中的表达显著高于癌旁腺体(P＜0.001);肿瘤细胞核中GPX1和SOD1的表达均与神经浸润有关(P=0.044和0.009);且两指标间存在正相关(P=0.022).结论 GPX1和SOD1的核表达均与腺样囊性癌神经浸润密切相关,对腺样囊性癌诊断和预后评估具有重要参考价值.
【期刊名称】《岭南现代临床外科》
【年(卷),期】2013(013)006
【总页数】4页(P537-540)
【关键词】谷胱甘肽过氧化物;超氧化物岐化酶;唾液腺;腺样囊性癌;免疫组化
【作 者】柳叶青;李海凤;韩静静;黄志权;李海刚
【作者单位】510120 广州 中山大学孙逸仙纪念医院病理科;510120 广州 中山大学孙逸仙纪念医院病理科;510120 广州 中山大学孙逸仙纪念医院病理科;510120 广州 中山大学孙逸仙纪念医院口腔科;510120 广州 中山大学孙逸仙纪念医院病理科
【正文语种】中 文
【中图分类】R739.87
唾液腺腺样囊性癌 （salivary adenoid cystic carcinoma，SACC），为常见的唾液腺癌，占唾液腺上皮性肿瘤的 10%～23.2%和唾液腺恶性肿瘤的24%。临床上癌瘤生长缓慢，但浸润性强，易侵犯神经，且易复发，远期生存率低［1］。目前，有关该肿瘤的研究主要集中于肿瘤发生发展机制及影响患者预后的分子标志物。氧自由基 （reactive oxygen species，R
OS）通过造成DNA碱基改变、单链断裂、抑癌基因的损害、增强癌基因的表达等一系列作用，在人类各种癌症的发生发展中起重要作用［2］。GPX1和SOD1是体内抗自由基体系的主要酶类，能够高效消除机体内活性氧自由基，避免细胞膜的氧化损伤和高氧条件下DNA的破坏，在维系机体或细胞内氧化还原平衡状态中起重要作用［3］。但是在肿瘤细胞中，GPX1和SOD1起着肿瘤促进和抑制的双重作用，上调GPX1的表达，可导致肿瘤细胞耐药增加［4］，SOD1活性的增强与口腔鳞癌的淋巴结转移呈正相关［5］。然而，GPX1和SOD1在恶性肿瘤中确切的作用机制尚不清楚，它们在SACC中的表达如何尚未见报道。本研究对GPX1和SOD1在SACC临床标本中的表达进行了初步检测，并对两指标的表达与临床病理学特征的关系等进行分析。
1 材料与方法
1.1 一般资料
收集2008年1月至2010年12月在中山大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科行手术切除的唾液腺腺样囊性癌标本35例，重新复查病理组织切片，确定组织学类型和分级，并选取肿瘤蜡块（其中18例伴有癌旁正常涎腺组织）做切片。其中男性18例，女性17例，患者年龄 23～8
1岁（中位年龄 50 岁）； 肿瘤大小 1～5.5 （3.05±0.96）cm，25例有肿瘤边缘浸润，21例伴有神经组织浸润，6例伴局部淋巴结转移；组织学类型：筛状型9例，实性型9例，管状型1例，混合型16例；按美国联合癌症分类委员会唾液腺癌的TNM分期，对肿瘤进行临床分期［6］：Ⅰ期 6例，Ⅱ期 21例，Ⅲ期 8例；组织学分级：1级 10例，2级16例，3级 9例，组织学分级参考以下标准，1级：肿瘤组织学类型主要以筛状型和（或）管状型为主，无实体型成分；2级：肿瘤组织中筛状型和（或）管状型和实体型成分均有，但实体型成分≤30%；3级：肿瘤组织中实体型成分＞30%［7］。 所有病例均随访 3年，4例复发，无因肿瘤死亡。所有病例术前均未行放射、化学及其它相关的抗肿瘤。
1.2 免疫组织化学染
实验采用免疫组化EnvisionTM二步法，操作步骤按说明书进行，一抗为兔抗人GPX1和SOD1单克隆抗体，均购自Abcam公司，稀释度分别为1∶50和1∶100。二抗均为辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠的二抗（北京中杉金桥公司），DAB显剂（北京中杉金桥公司）。4μm厚白片经脱蜡水化后，染GPX1的切片采用微波炉进行抗原修复（10 mM EDTA， pH 8.0），染 SOD1 的切片采用高压锅进行抗原修复 （枸橼酸钠，pH 7.4）， 室温冷却后PBS
冲洗，滴加一抗，4℃冰箱孵育过夜；取出后置室温下复温 1 h，PBS冲洗，5 min×3次， 滴加二抗， 室温孵育 30 min，PBS 冲洗，5 min×3 次；DAB显，蒸馏水冲洗，苏木精衬染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。用PBS取代一抗为空白对照，依据抗体说明书设阳性对照。
1.3 判断标准
于200倍视野观察整张切片，选取3～5个免疫组化“热点”进行观察。免疫组化染呈阳性细胞数≥10%为阳性（＋），＜10%计为阴性（－）。 结果评判由2名病理医师进行双盲读片确定。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学处理。资料采用确切概率法比较两组阳性率的差别，肿瘤大小比较采用t检验，两参数间相关分析采用 Pearson 法。 取 α＝0.05 水平，以 P＜0.05 为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 GPX1和SOD1在SACC及癌旁腺体中的表达
reactive阳性是什么
35例SACC组织都表达GPX1和SOD1，其中单纯胞核表达的分别为5例、13例，单纯胞浆表达的分别为14例、10例，胞核和胞浆均表达的分别为16例、12例。胞核与胞浆中的SOD1表达呈负相关（Pearson 法，r＝－0.486，P＝0.003）。 肌上皮细胞和变异的导管上皮细胞均可表达GPX1和SOD1，两种细胞的表达与生物学行为无关。
18例癌旁腺体中，GPX1的表达在导管和浆液腺均阳性（均为胞浆表达，未见胞核表达），粘液腺均阴性。SOD1的表达在导管、浆液腺、粘液腺均阳性（均为胞浆表达，未见胞核表达）。与癌旁正常组织相比，这两个指标在SACC中的胞浆表达量下降，胞核表达量增强（见图1、图2）。
表1 SACC中胞核GPX1和SOD1阳性与神经浸润的关系a P＝0.044，b P＝0.009GPX1表达SOD1表达神经浸润 － ＋ － ＋无有例数（%）9（25.7）5（14.3）例数（%）5（14.3）16（45.7）例数（%）8（22.9）6（17.1）a例数（%）12（34.3）19（54.3）b
2.2 GPX1和SOD1在SACC组织中表达的相关性
图1 唾液腺腺样囊性癌组织中GPX1的胞核表达
图2 唾液腺腺样囊性癌组织中SOD1的胞核表达
35例SACC组织中，有18例同时核表达GPX1和 SOD1，有 7例同时核不表达 GPX1与SOD1，有3例单独核表达GPX1，有7例单独核表达SOD1。通过关联性分析，在SACC组织中GPX1核表达与SOD1核表达呈正相关 （Pearson法，r＝0.387，P＝0.022）。
2.3 GPX1和SOD1与SACC临床病理特征的关系
在 SACC中，GPX1和SOD1在胞核的表达，与 神 经 浸 润 有 关 （ 精 确 概 率 法 ，P＝0.044、P＝0.009），与性别、年龄、组织学类型、组织学分级、肿瘤大小、周围组织浸润、淋巴结转移、TNM分期、3 年内复发均无关（P＞0.05）。
在 SACC中，GPX1和SOD1在胞浆的表达，与性别、年龄、组织学类型、组织学分级、肿瘤大小、神经浸润、周围组织浸润、淋巴结转移、TNM分期、3 年内复发均无关（P＞0.05）。
3 讨 论
由于氧自由基在肿瘤的发生、发展上起着重要的作用，因而抗氧化酶与肿瘤的关系逐渐受到重视。SOD是机体内唯一以O2－为作用底物的酶，它使氧自由基产生歧化反应，生成O2和H2O2，H2O2在GPX作用下，生成无毒性的H2O和O2。研究证实，与正常细胞相比，肿瘤细胞需要对细胞内过多的活性ROS作出防御反应来求得生存［8］。大量研究报道，GPX1和SOD可以在严重氧化应激环境下保护肿瘤细胞，促进癌症的恶性进程［5，9］。但是，GPX1和SOD1的高表达又是口腔黏膜鳞状细胞癌预后良好的重要因素 ［10］。而且有报道说SOD可能是潜在的新型肿瘤抑制基因，具有抑制肿瘤细胞生长的功能［11］。对结肠癌的研究显示，GPX2蛋白的低表达与结肠癌的发生呈明显的正相关，在结肠癌细胞中过表达GPX2能抑制前列腺素环氧化酶2的作用，减少PGE2的形成，显著抑制结肠癌细胞的侵袭和转移［12］。 Salzman［13］等和Yokoe［14］等曾报道，伴有高活性 SOD的口腔鳞状细胞癌患者，更倾向于发生淋巴结转移。可见GPX和SOD在肿瘤发生发展中的生物学行为极其复杂。
本实验发现，与正常唾液腺组织相比，GPX1和SOD1在SACC中表达的差异性体现在胞核表达的增强和胞浆表达的减弱，同时GPX1和SOD1的核表达与SACC神经浸润呈正相关。目前，这个发现还尚未报道过。Huang［15］等在肝细胞癌的研究中发现，在肿瘤细胞内的氧
化应激条件下GPX1的定位可从细胞质迁移到细胞核，这一现象可能会增强GPX1的抗氧化功能；同时，GPX1活性的增强与肝癌血管浸润相关。在恶性肿瘤中，GPX1和SOD1表达水平的增加，表达部位的变化，活性的增强可能是对肿瘤细胞内高氧化应激状态的代偿性反应；同样，恶性程度越高的肿瘤细胞内更高水平的氧化应激可能是导致其侵袭转移的主要原因，与GPX1或SOD1的表达水平和活性没有直接因果关系。目前研究较清楚的是大部分的GPXs家族成员的表达都高度依赖硒元素；同时其表达还受到核转录因子的调控。如GPX1编码基因的启动子上存在细胞核因子kappa B（NF kappa B，NF－κB）和转录因子AP1的结合位点，在高氧状态或炎症因子等因素刺激下，NF－κB和转录因子AP1能结合到GPX1编码基因的启动子上，促进GPX1的转录表达［16］。 本研究结果提示，GPX1和SOD1蛋白对SACC的影响可能由其表达部位决定，表达于胞浆的GPX1和SOD1发挥着抗活性氧自由基的作用，而表达于胞核的则无此功能，而与肿瘤的恶性行为有密切关系。
本实验结果显示，在SACC中，GPX1核表达和SOD1核表达呈正相关，且两者的表达部位均有向核迁移的现象，可能这两者在恶性肿瘤中的生物学效应具有一致性，且受相同信号通路的调控。有研究发现，高表达的SOD促进肿瘤细胞生长，中等量表达的SOD则抑制肿瘤细胞生长［17］。关于这种双重作用机制的原因还需要更多相关研究。
综上所述，GPX1和 SOD1在 SACC的发生、发展过程中发挥着重要作用，对SACC患者的诊断和预后评估具有重要参考价值。对其作用机制的深入研究，可能对肿瘤发生机制的揭示有价值，可为肿瘤靶向、抗肿瘤药物耐药性及恶性肿瘤的诊断和预后提供新的思路。
参考文献
【相关文献】
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［4］Vibet S， Goupille C， Bougnoux P， et al.Sensitization by docosahexaenoic acid.（DHA）.of breast cancer cells to anthracyclines through loss of glutathione peroxidase.（GPx1）response ［J］.Free Radic Biol Med， 2008， 44（7）： 1483－1491.

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