收稿日期:2001-01-10
基金项目：浙江省青年科技人才基金(RC9604)；浙江省重点实验室专项基金资助
作者简介：张恒木(1970-)，男，安徽滁州人，博士研究生，主要从事分子生物学研究。
3通讯作者　E 2mail :jpchen @mail.hz.zj
浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis 13(2):55～60,2001                        　
烟草抗烟草花叶病毒基因N 的研究
张恒木1,2，陈剑平2,3，程　晔2
(1浙江大学农业与生物技术学院，浙江杭州310029;2浙江省农业科学院病毒研究室，浙江杭州310021)
摘　要：烟草的N 基因是一个较为理想的抗烟草花叶病毒)tobacco m osaic virus ,T M V )基因，它和
T M V 之间的互作是植物和病毒互作领域里一个经典的系统。烟草N 基因已经分离,T M V 基因组结
构和功能已经研究得很清楚，这为进一步研究两者的互作奠定了基础。本文介绍了这一领域取得的最新进展和存在的问题。
关键词:N 基因;T M V 复制酶；过敏反应(HR )中图分类号:Q754;S432.4+1  　文献标识码:A
文章编号:1004-1524(2001)02-0055-06
Study on the resistant gene N of tob acco to tob acco mosaic virus(TMV ):ZH ANG Heng 2mu 1,2,CHE N Jian 2ping 2,3,CHE NG Y e 2(1College o f Agriculture and Biotechnology ,Zhejiang Univer sity ,Hangzhou 310029,Chi 2na ;2
Virology Laboratory ,Zhejiang Academy o f Agricultural Sciences ,Hangzhou 310021,China )
Abstract :The N gene of tobacco is a resistant gene to tobacco m osaic virus (T M V ).The interaction between the N gene and T M V is a classical system in the kingdom of plant 2virus interaction systems.The N gene has been cloned and sequenced.The genome organization of T M V is well studied.All these results provide a s olid foundation for further study on interaction between tobacco and T M V.This paper reviewed the recent progresses and problems in the field.
K ey w ords :N gene ;T M V replicase ;hypersensitive response
  烟草N 基因的英文意思是“对T MV 侵染的坏死型反应”，这是一个单显性基因，首先在心叶烟中发现。H olmes (1938)通过渐渗杂交将抗T MV 基因N 导入普通烟草。N 基因介导的抗T MV 有两个显著特点:(1)
T MV 侵染后大约48h 就发生过敏反应(hypersenstive response ,HR )，即在侵染点部位产生枯斑,T MV 被限制在枯斑或其邻近部位，枯斑的大
小、数量以及形状与接种的T MV 浓度有关[1];(2)烟草N 基因介导的抗病性具有温度敏感性，即当携带N 基因的烟草接种T MV 后，在28℃以下培养时，发生HR ，抗T MV 功能正常，较高温度时,T MV 能够在携带N 基因的烟草植株内扩散，如果将已经扩散的烟草移到低于28℃的条件下培养，则发生系统性HR 。
目前已经利用转座子标签法和N 基因的温度敏感性分离了N 基因[2,3]，其结构、功能及表达特点都得到了深入研究。
1　N 基因的结构特点
  N基因能够编码一个131.4kDa的蛋白质，不存在跨膜区域和信号序列，可能是细胞质蛋白；含8个N2连糖基化位点，一致序列为NX(S/T)，氨基端结构类似于果蝇的T oll 蛋白和哺乳动物的白介素21受体(interleukin2 1receptor,I L21R)的胞质部分，还有和其它抗病基因相似的NBS和LRR结构域。
1.1　NBS结构
N蛋白存在形成NBS所需的3个结构域：第一个结构域为P2发夹(loop)结构，在结合ATP/G TP的磷酸化
过程中起作用，一致序列为(A/G)XXXXGK(S/T),N蛋白AA216-223序列为G MGG VGK T，符合P2发夹结构的特征；第二个结构域为K inase2，即4个连续的疏水AA，紧挨着一个天冬氨酸(D)，该氨基酸残基在磷酸转移反应中催化二价阳离子Mg2+或Ca2+可逆的转移，距离P2发夹结构74AA的序列LI V LD(AA297-301)符合K i2 nase2结构；第三个结构域为K inase3a，具有参与结合嘌呤或核糖的功能，一般离P2发夹结构126AA处，都含有一个酪氨酸(Y)或精氨酸(R)。在N蛋白上，离P2发夹97AA处(AA320-325)，序列为FG NG SR，符合K inase 3a结构域。NBS结构曾在激酶、ATP酶和Ras蛋白中发现,N蛋白含有相似的NBS结构暗示了结合ATP/G TP很可能是N蛋白行使功能所必需的，提纯N蛋白继而研究N蛋白的NBS结构与功能将是很有意义的。
1.2　LRR结构域
N蛋白AA590-928含有LRR区域，含14个不完全的重复，每个重复长约26AA，即PXX aXX LXX LXX LX LXXXXX LXX L(a代表脂族氨基酸,X代表任意氨基酸)。LRR在参与信号传导、细胞粘附及其它功能蛋白中也存在。一般认为LRR介导蛋白质2蛋白质或蛋白质2细胞膜之间的特异性互作。N蛋白可能通过LRR结构进行蛋白质2蛋白质互作而发挥功能。1.3　细胞质结构域
N基因的N2端AA82150和果蝇T oll蛋白、哺乳动物的I L21R蛋白的细胞质部分相似,N2蛋白的N端和T oll蛋白的AA854-988同源性高达55%，和I L21R的AA3632526同源性达49%，和小鼠MyD88蛋白同源达44
%。在果蝇中,T oll的胞外区域识别未知信号，激活转录因子，调节一套参与背腹极性的合子基因的转录;I L21途径中，通过细胞因子I L21和I L21R相互作用，激活转录因子NF2 kB，并使之移位，随后,NF2kB诱导了多种防卫和信号蛋白的合成。T oll和I L21R蛋白胞质区域对激活下游事件是必不可少的。这种相似性暗示了N蛋白可能作为受体识别T MV复制酶，通过类似于T oll2I L21R的途径，引起HR的信号传导过程中激发了胞内信号传递的级联系统。仅仅导入N基因就可使感病烟草获得T MV抗性，表明N基因对T MV 的抗性是必要的而且是充分的，也暗示了N 基因产物是识别T MV，诱导HR的决定因素。
和抗细菌基因RPS2相比，二者的基因产物同源性很高，在氨基端均有一个P2发夹结构，羧基端大部分由LRR组成,P2发夹结构和LRR之间还有一段序列G LP LA L是保守的。已知NBS2LRR类R基因可抗分类上完全不同的病源：病毒、细菌、真菌。很可能在植物王国里识别病原和诱发HR的机制是一致的，存在共同信号传导途径。
2　N基因的表达特点
  烟草抗T MV基因N的5个外元经选择性剪切可编码N S和N L两个转录物[4]。Ns 由N基因的5个外元剪接到一起，编码N蛋白,1144AA,131.4kDa,T oll2I L21R,NBS,14个LRR，在T MV侵染后3h之内以Ns为主。N L 通过选择性剪接内元Ⅲ内部的70bp AE形成，编码截短的N tr蛋白,652AA,7513kDa, T oll2I L21R,NBS,1个LRR，在T MV侵染后4～
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8h，以N L为主。包含AE的N L引起了一个移框，结果导致翻译提前终止于外元Ⅳ的第一个LRR之后，因此，较长的转录物N L编码了一个截短的N蛋白即N tr。N tr氨基端的616AA和全长N蛋白氨基端616AA完全相同，只是由于移框在羧基端N tr包含了另外的36AA，序列分析N tr的羧基端的36AA看不出有何功能。一个基因通过选择性剪接形成几种蛋白，通过一定的调控机制在不同发育阶段或不同类型的细胞中表达，行使不同的功能，如：细胞因子受体和其截短的形式竞争配体或参与受体之间的互作;T oll2受体截短的形式则增强全长T oll2受体的功能。N基因的两个转录物及其表达时间和比率都是完全抗T MV所必需的[4],N基因的选择性剪接受到许多信号调控。
2.1　AE在选择性剪接中的作用
N基因内元Ⅲ上的AE的两侧存在剪接所必须的一致序列———供点和受点，在纤连蛋白中,270bp的外元内部存在两个顺式成分(G AAG AAG A和C AAGG)，他们在调控选择性剪接过程中起作用。在烟草N基
因AE1外元中也存在相似的顺序成分，可能存在同样类型的剪接形式。缺失AE及其上下游的剪接位点仅引起部分抗性，表明AE序列通过对选择性剪接的调控在T MV抗性反应中起重要作用。
2.2　N基因的3πN2G S(N2genomic sequences)影响选择性剪接
N基因的1.4kb的3πG S中含有正确表达N基因的调节序列，转带有cDNA2Ns2内元Ⅲ23πG S的植株表现出了对T MV完全的抗性，用NOS终止子序列代替3πG S则表现出不完全抗性,RT2PCR检测发现转cDNA2Ns2内元Ⅲ2NOS的植株仅表达Ns转录物而没有N L 转录物；而转cNDA2Ns2内元Ⅲ23πG S的植株两种转录物均存在，而且两种转录物的比率和含N基因野生型的植株相似。3πG S是被转录的，而且含有一个内元，在前体RNA中被加工。这些结果清楚表明3πG S影响N基因的剪接,3πG S代表了调控前体mRNA选择性剪接或其稳定性的必要的远距离的调控成分。
2.3　T MV侵染调节N基因的选择性剪接
T MV信号调节细胞的Ns和N L比率。定量RT2PCR分析表明在T MV侵染前后该比率变化显著(表1)。在T MV侵染前和侵染3h之内,Ns与N L的比值约为28∶1，但是在侵染4h后，转录物Ns和N L的比率急剧变化，由28∶1到1∶23。这些结果表明T MV信号引发了N基因的选择性剪接。尽管二者的比率在侵染后产生显著的变化，但Ns+N L 的总量在T MV侵染前后却没有变化。Ns和N L的相对比率是重要的，干扰Ns和N L的比率将导致T MV抗性的丧失，仅以1∶1的比率表达Ns和N L不足以完全抗T MV，但这种比率变化又是
暂时的、可逆的,T MV侵染9h 后，就恢复到了侵染前的水平。那么T MV信号是如何调节Ns和N L的比率或N基因的选择性剪接的呢?已知复制酶126kDa是N基因介导的抗性的激发子，而T MV的复制酶已定位在内质网的细胞质面，二者又是如何相互作用，诱导发生在核内的选择性剪接或改变mRNA的稳定性?其中一个可能是:Ns转录物编码的N蛋白在侵染早期直接或间接地与T MV激发子2126kDa复制酶相互作用，诱导了一个调节N基因选择性剪接的信号链产生N L转录物。已经清楚有许多胞外的或生理的刺激，如：生长因子、激素、细胞因子、胞外pH、热休克、Ca2+和蛋白质激酶等与选择性剪接有关。N2T MV互作能够迅速诱导ROS(reactive oxyegen species)、氧化氮(Ni2 tric oxide)、Ca2+和离子流、丝/苏氨酸蛋白质激酶、MAPK(mitogen activated protein kinase cascade)以及防卫反应基因。因此,N2T MV互作诱导的Ca2+第二信使、蛋白质激酶或别的
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张恒木等：烟草抗烟草花叶病毒基因N的研究
表1　T M V侵染引起的Ns:N L的比率变化
T able1　Ratio of Ns:N L after T M V in fection
转录物05m in30m in1h2h3h4h5h6h8h9h24h Ns282525282520811122825 N L1111111  1.523111
未知信号都可能在T MV侵染后充当诱导N 基因选择性剪接的信号。
在许多真核细胞系统中，前体mRNA的选择性剪接受到顺式成分和反式作用因子的调控，尤其是内元的长度、序列，外元的长度及其邻近的序列，以及RNA的二级结构等。cDNA2Ns、AET3πG S是完全抗T MV所必须的最少的序列，这一区段里包含了N基因选择性剪接和T MV抗性所必需的顺式成分。非常有趣的是，属于TIR2NBS2LRR类的R基因预测均能编码多个转录物，但这些转录物在抗病中的具体功能还不清楚。研究N基因的选择性剪接机制将有助于理解N和N tr蛋白在抗T MV中的功能。
3　N基因和T MV之间的互作
  病毒基因和植物基因互作决定了病毒能否成功地侵染植物。T MV20b是唯一能够系统侵染N基因烟草的T MV分离株[5,6]，但是，这又是有条件的，低于19℃,T MV20b能够诱导N基因介导的HR。序列分析发现仅有126kDa基因上一个核苷酸的变化就决定了它能否引发HR;T MV复制酶126kda/183 K da蛋白是激发N基因介导的HR所必须的，其螺旋酶活性部位AA692-1116是激发HR所需的最小序列[7]，但目前尚不
清楚该复制酶的活性部位能否介导HR，也不能确定它是否为唯一的激发子，也有可能别的病毒成分是必须的。用T MV183kDa蛋白基因在强组成型启动子控制下转化NN烟草，发现转基因植株和未转基因植株都没有发生HR[8]，也许可能由于复制酶蛋白不能积累到激发HR的阈值水平，或者还需要其它的病毒成分才能诱导HR。高温抑制T MV诱导HR的早期事件，病毒T MV影响N基因HR 介导的温度敏感性，不能激活HR的温度对于T MV和0b突变株之间是不同的，暗示了温敏性也反映了病毒的特性；提高温度可能减弱了病毒激发子和N基因之间的相互作用[6]。总之,N基因介导的抗病温敏性反映了病毒和宿主之间温敏性互作的特点。
T MV是杆状正义单链RNA病毒，仅由一种外壳蛋白和一条RNA基因组构成,T MV复制酶作为N基因激发子在病毒颗粒中并不存在，所以T MV要产生复制酶分子，就必需先脱壳,RNA基因组才能表达。已经清楚, T MV RNA基因组可直接充当复制酶的mR2 NA,T MV通过机械损伤进入植物细胞，在细胞质中，通过脱壳和翻译偶联机制[9]，细胞质核糖体使得病毒颗粒脱壳，同时基因组RNA 得到翻译，第一个翻译产物即是复制酶；反过来，病毒复制酶和寄主因子(56kDa)组成病毒复制酶复合物[10]，导致了T MV RNA基因组在宿主细胞质中增殖。这些事件可能是产生N基因介导的HR激发子所必需的，因为病毒颗粒、MP和CP都不能单独诱导N基因介导的HP[11,12]。T MV复制酶及其基因表达的确发生在HR起始之前。T MV的增殖循环是在宿主细胞质中完成的,T MV复制酶已经定位在内质网上[13]，由此看来,T MV复制酶作为激发子和N基因编码的蛋白在细胞质中相互作用的观点是恰当的。可是，目前尚没有直接证据来表
明N蛋白和其可能来自病毒的配体之间的物理的相互证据。两者究竟如何互作仍然是个非常具有吸引力的课题。T MV的RdRp的纯化和N基因的克隆为进一步研究复制酶和N蛋白之间的互作提供了良好的基础。
4　N基因介导的抗病反应和信号传导  植物主动抗病反应可分为三个阶段:1.
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识别;2.信号传导;3.防卫反应。烟草N基因介导的T MV抗性也不例外，识别病原经系列信号传导产生防卫反应。HR是许多植物第一个防卫反应，具有病原特异性，通常由单显性R基因介导。HR可限制T MV于枯斑及其邻近部位[1]。HR随后诱导整个植株非特异的普遍的防卫反应，即S AR。S AR期间,N 基因和T MV互作诱导了许多防卫相关物质积累，如:PR蛋白、AVF(antiviral factor,AVF)、I VR(inhibitor of virus replication)、ngRBP(nico2 tiana glutinosa glycine2rich RNA binding pro2 tein)[14]等。HR的起始和S AR都需要植物体内存在一种信号分子，尤其是S AR，必定存在一种信号从侵染部位传至植株的其它部
位。至今为止，对防卫信号传导的过程仍然了解得很少。S A被认为是一个天然系统信号分子[15,16]。外源S A能激活多种抗病反应，如产生植保素、蛋白酶抑制剂以及壁物质沉积，均可使nn烟草抗T MV;T MV侵染NN基因型烟草后，内源S A的水平显著增加并保持高水平的自由S A[15,16]。转S A水解酶基因的N 基因烟草，不能限制T MV于侵染点部位，此时外源的S A也不能诱导S AR以及PRp的积累[17]；烟草一种可溶性蛋白结合S A可能在抗病反应的信号传导中起作用[18]。N基因介导的HR需要丝/苏氨酸蛋白质磷酸化酶类型1[19]。在哺乳动物和果蝇的免疫反应过程中,T oll/I L21R途径利用了蛋白质磷酸化作用，激活转录因子，将外源刺激传至核内，快速诱导防卫相关基因的表达。N蛋白和T oll/I L21R的同源性暗示了烟草N基因介导的信号传导途径可能与此类似:N蛋白作为受体，和T MV复制酶互作，通过T oll/I L2like 途径，利用可逆的磷酸化作用，激活了转录因子，迅速诱导HR等防卫相关基因表达，但具体的信号传导途径仍有待进一步研究。
5　结论
  T MV能够侵染200多种植物，包括番茄、胡椒、烟草等重要经济作物，不仅影响产量，而且影响产品的质量，造成重大经济损失。在已发现的抗T MV基因中,N基因是最有效的，可抗T MV和其它绝大多数烟草花叶病毒组成员。N基因是一个单显性基因，很容易进入烟草的育种程序，转番茄、烟草中均已得到了有效抗T MV的转N基因的植株[2,20]，这为抗病基因的利用开辟了新空间，为利用NBS2LRR类R基因提供了范例。转基因技术和传统育种技术相结合，能够使N基因在不同的品种之间转移，这为抗T MV
育种提供了有效的途径。值得一提的是，在番茄[20]、马铃薯[21]、水稻中都存在N基因同源序列，可能是别的R基因，对这些R基因和N基因进行比较研究对进一步理解烟草N基因介导的抗病机理将会有很大帮助。
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