·综    述·
PUMA 在卵巢衰老中的作用研究进展#*
陈郅瑶* 吕梦丹 张怡 张晗 郭燕君△
（嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314001）
摘要 卵子储存在原始卵泡中，每个卵泡都包含一个未成熟的卵母细胞，该卵母细胞被单层颗粒细胞包裹。PUMA （p53-up-regulated modulator of apoptosis ）作为调节生殖细胞死亡的关键因子，在卵子迁移阶段和性腺中卵母细胞数量的维持方面发挥重要作用。PUMA 是卵巢发育过程中生殖细胞数量的关键决定因素，PUMA 敲除可以保护诱导DNA 损伤的原始卵泡，维持卵泡正常生育能力。本文综述PUMA 在卵母细胞数量维持、DNA 损伤的原始卵泡以及颗粒细胞凋亡中的作用机制，为预防卵巢早衰提供新的思路。 关键词：PUMA ；原始卵泡；颗粒细胞；DNA 损伤
女性生殖衰老是由卵巢衰老引起的，出生时卵巢原始卵泡池中卵母细胞数量是女性未来生育能力和卵巢内分泌功能的关键决定因素。雌性哺乳动物生殖的基本功能单位是卵泡，而原始卵泡则是卵泡发育的起点。
在大多数哺乳动物物种中，原始卵泡的形成与数量决定发生在出生前或新生阶段。如果原始卵泡供应过早枯竭，出生后也不可能制造新的原
始卵泡[1]。
研究发现，在化疗药物的作用下，原始卵泡由于其基因组完整性受到破坏而大量减少。这可能是由于化疗药物通过PI3K/AKT/FOXO3a 信号通路加速了原始卵泡的激活和成熟，最终耗尽原始卵泡的卵巢储备[2]。这也是导致卵巢早衰和不孕的可能原因。颗粒细胞可为卵母细胞提供营养和促成熟调节因子，保证卵母细胞发育成熟，在卵母细胞成熟过程中它能通过自身的抗氧化系
统保护卵母细胞免受氧化应激损伤[3-4]。
颗粒细胞凋亡是卵泡内的一种生理现象，可引起卵泡闭锁
及卵泡数量减少[5]。
因此，卵巢颗粒细胞的凋亡是导致卵巢早衰的主要病因之一。
PUMA 是2001年发现的一种促凋亡基因，其编码蛋白是一种仅含一个BH3结构域的Bcl-2
相关蛋白家族蛋白[6]，
也称为BBC3（Bcl-2 binding component3），因其可以被p53快速诱导转录及其编码的蛋白具有强大促
凋亡作用而得名[7]。PUMA 的主要生理功能是诱导受损或应激的细胞凋亡，参与调节卵巢衰老生理过程。本文综述PUMA 的生物学活性和调控卵巢衰老的机制。为延长生殖寿命和提高生育能力奠定基础。
#基金项目：浙江省公益技术应用实验动物项目（编号：LGD21H160003）；嘉兴学院南湖学院大学生研究训练（SRT ）项目（编号：NH8517203120，NH8517203121）；
*作者简介：陈郅瑶，女，临床医学本科在读，主要从事肿瘤耐药研究，Email ：****************； △通讯作者：郭燕君，女，讲师，主要从事生殖生物学研究，Email ：******************。
1 PUMA 的结构与功能
PUMA 基因（19q13.3）导致促凋亡BH3蛋白的表达。PUMA 转录本的长度约为1.6~1.9 kb ，PUMA 基因具有4个外显子和三个内含子，转录后形成四种不同的剪接体（PUMA-α、PUMA -β、PUMA -γ及PUMA -δ），只有含有BH3结构域的PUMA α和PUMA β显示促凋亡活性。它们可以与线粒体膜中的Bcl-2家族成员相互作用，驱动细胞素C 从线粒体重新定位到细胞质中。除了含有BH3结构域的蛋白质外，PUMA 与其他已知蛋白质没有显著的同源性。人和小鼠PUMA 序列的比对表明约90%的同一性[8-10]。
PUMA 位于线粒体外膜，通过直接或间接抑制抗凋亡Bcl-2家族成员而启动凋亡，这种相互作用减轻了线
粒体膜对促凋亡Bax/Bak 基因的抑制作用，从而导致细胞素C 释放，凋亡小体形成，Caspase 激活以及随后的细胞破坏。PUMA 介导由细胞核和细胞质p53诱导的细胞凋亡。还驱动由p53非依赖性信号诱导的凋亡，如生长因子剥夺或暴露于糖皮质激素或佛波酯。
2 PUMA 调控卵巢衰老的机制
2.1 调节小鼠生殖细胞丢失和原始卵泡发育
最初在卵巢内建立的原始卵泡的数量受胚胎卵巢发育过程中生殖细胞死亡程度的影响，但机制尚未完全揭示。Myers 等人研究发现，PUMA 是卵巢发育过程中决定生殖细胞数量的关键决定因素[11]。早在胚胎第13.5天，Puma 基因的靶向敲除就显示出生殖细胞数量的显著增加。在之后的
四川生理科学杂志2021, 43(3)                                527
胚胎阶段和出生后早期，Puma-/-雌性小鼠的生殖细胞数量与WT雌性小鼠相比保持升高，出生后第10天卵巢中原始卵泡数量增加1.9倍。但在Puma-/-雌性的卵巢中观察到的生殖细胞数量的增加并非由于卵巢中生殖细胞增殖活性的改变。研究还显示PUMA是生殖细胞死亡的关键调节因子，在卵子发生的迁移阶段或生殖细胞到达性腺后不久起作用，PUMA介导的细胞死亡限制了最初卵巢储备中建立的原始卵泡的数量[11]。因此PUMA基因的缺失可保护卵巢储备，并保持生育能力。但PUMA基因的缺失不会影响到生殖细胞巢破裂时大量生殖细胞丢失的发生。
2.2 调控卵泡闭锁
颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的潜在机制之一。活性氧（Reactive oxygen species，ROS）在卵泡发育和存活中起重要作用。柠檬酸循环中形成的副产物ROS可能通过与细胞中的脂质、蛋白质和核酸相互作用而引起氧化损伤。当细胞内调节氧化和还原过程之间的平衡被破坏，并且细胞无法修复由此产生的氧化损伤时，增加的ROS 会诱导细胞发生氧化应激[12]。与年龄相关的卵母细胞质量和生育能力下降都是由氧化应激调节的[13]，且氧化应激也促进颗粒细胞凋亡[14]。颗粒细胞对活性氧敏感。尽管内源性H2O2是重要的信号分子，但高水平的H2O2可能会导致细胞功能障碍和细胞死亡，含H2O2的ROS在颗粒细胞凋亡中起关键作用。
研究表明H2O2可以诱导卵巢颗粒细胞凋亡[15]，包括降低抗凋亡分子（如Bcl-2，Bcl-xL和Mcl-1）的表达，以及增加促凋亡因子（如Bax，Bak和PUMA）的表达。实验证明过表达puma可加强H2O2诱导的颗粒细胞凋亡，而敲除puma基因会显著降低了这种细胞凋亡，由此确认PUMA 是颗粒细胞凋亡的参与者。由于PUMA直接诱导Bax和Bak的逐步激活，故PUMA上调会导致颗粒细胞凋亡。另一方面，过表达的Bcl-xL可抑制H2O2诱导的颗粒细胞凋亡[28]。此外，Bax和Bak 的自主活化可以独立于激活剂BH3s，下调Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1[29]。因此，H2O2诱导的颗粒细胞凋亡机制是由于Bax和Bak的激活，通过增加PUMA和减少抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1来介导的。这些结果均提示抑制PUMA可能提高颗粒细胞的存活率，对卵巢颗粒细胞凋亡相关的卵泡闭锁有有益的作用。2.3 诱导DNA损伤原始卵泡卵母细胞
凋亡和生育力丧失
研究发现PUMA和NOXA对DNA损伤诱导的转化相关蛋白63（Transformation-related protein 63，Trp63）介导的原始卵泡卵母细胞凋亡至关重要。Trp63是一种与肿瘤抑制因子p53相关的转录因子，属于原始卵泡卵母细胞细胞核中主要的Trp53家族成员，对体内DNA损伤引发的细胞凋亡至关重要。γ射线照射后，在成年野生型和Trp53-/-小鼠的原始卵泡卵母细胞中只观察到促凋亡成员Puma和Noxa的诱导，而在Trp63缺陷小鼠中未观察到Puma和Noxa的诱导。Puma缺陷或Puma和Noxa缺陷的小鼠的原始卵泡卵母细胞被保护免受γ射线辐射诱导的凋亡，并且可以产生健康的后代[16]。DNA损伤诱导Trp63介导的原始卵泡卵母细胞凋亡机制总结如图1所示。
图1 DNA损伤诱导Trp63介导的原始卵泡卵母细胞凋亡
机制
诱导凋亡的DNA损伤导致Trp63的激活，PUMA和NOXA的直接的或间接的转录诱导，随后PUMA和NOXA蛋白与促存活的BCL-2家族成员（BCL-2、BCLXL、BCL-W、MCL-1）结合，也可能是PUMA与BAX/BAK的直接结合激活BAX和BAK，导致卵母细胞凋亡。
2.4 PUMA缺失可保护卵巢储备免受化疗药物的损伤
Quynh等人使用基因缺失小鼠模型来研究DNA损伤诱导的促凋亡蛋白PUMA及其转录激活因子Trp63在环磷酰胺或顺铂引起的原始卵泡衰竭中的作用[17]。环磷酰胺几乎完全破坏了成年野生型小鼠的原始卵泡池，顺铂也被观察到了显著的破坏作用。与此形成鲜明对比的是，Puma-/-小鼠在任何一种基因毒性后都保留了100%的原始卵泡。
图2环磷酰胺和顺铂诱导DNA损伤后卵母细胞凋亡的
途径
此外，仅敲除PUMA就完全保持了环磷酰胺处理小鼠的生育能力，研究表明从DNA损伤诱导的死亡中拯救出来的卵母细胞可以自我修复，足以支持生殖功能和后代健康。顺铂后Trp63−/−小鼠的原始卵泡
也得到保护，但环磷酰胺后Trp63−/−小鼠的原始卵泡没有得到保护。PUMA转录激活的途径可能不同，顺铂激活Trp63依赖的过程，而环磷酰胺通过Trp63非依赖的途径起作用。研究表明不同化疗药物诱导的DNA损伤中，诱导凋亡和卵巢储备减少的机制不同，PUMA是细胞凋亡的关键效应物，PUMA导致暴露于环磷酰胺或顺铂后原始卵泡的衰竭，抑制PUMA可能是妇女癌症期间有效的卵巢保护策略。环磷酰胺和顺铂诱导DNA损伤而导致卵母细胞凋亡的分子途径总结如图2所示。
顺铂引起的DNA损伤激活了一条信号通路，其中Trp63起着关键的调节作用，下游转录诱导Puma，最终导致凋亡效应物BAX和BAK的释放。环磷酰胺诱导的DNA损伤激活了一种不需要Trp63的替代信号通路；可能的介质是FOXO3a或p53。实心箭头表示已知路径。虚线箭头表示可能的替代路径。reactive oxygen species是什么意思
4 总结与展望
综上所述，PUMA是卵巢发育过程中生殖细胞数量和原始卵泡发育的关键决定因素，抑制PUMA可能通过提高颗粒细胞的存活率来减少卵泡闭锁，PUMA是Trp63诱导的原始卵泡凋亡的关键效应物。然而，PUMA与生殖细胞数量、原始卵泡的发育和颗粒细胞凋亡三个方面的机制尚未清楚，仍有待进一步研究。特别是卵巢癌化疗方面，破坏DNA的癌症化疗会耗尽原始卵泡的卵巢储备，导致卵巢早衰和不孕。进一步探索PUMA在卵巢癌化疗驱动的卵泡丢失的确切机制将有利于促进靶向卵巢保护剂的发展。在癌症期间通过阻断Puma来保护女性生育能力，对于防止过早绝经、改善女性健康、和为人类生殖临床提供理论基础方面将有着积极的意义。
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Guided versus standard antiplatelet therapy in patients undergoing percutaneous coronary
intervention: a systematic review and meta-analysis
Mattia Galli, et al.
Background: Whether guided selection of antiplatelet therapy in patients undergoing percutaneous coronary intervention (PCI) is effective in improving outcomes compared with standard antiplatelet therapy remains controversial. We assessed the safety and efficacy of guided versus standard selection of antiplatelet therapy in patients undergoing PCI.
Methods: For this systematic review and meta-analysis, from Aug 20 to Oct 25, 2020, we searched MEDLINE (via PubMed), Cochrane, Embase, and Web of Science databases for randomised controlle
d trials and observational studies published in any language that compared guided antiplatelet therapy, by means of platelet function testing or genetic testing, versus standard antiplatelet therapy in patients undergoing PCI. Two reviewers independently assessed study eligibility, extracted the data, and assessed risk of bias. Risk ratios (RRs) and 95% CIs were used with random-effects or fixed-effect models according to the estimated heterogeneity among studies assessed by the I2 index. Coprimary endpoints were trial-defined primary major adverse cardiovascular events and any bleeding. Key secondary endpoints were all-cause death, cardiovascular death, myocardial infarction, stroke, definite or probable stent thrombosis, and major and minor bleeding. This study is registered with PROSPERO (CRD42021215901).
Findings: 3656 potentially relevant articles were screened. Our analysis included 11 randomised controlled trials and three observational studies with data for 20 743 patients. Compared with standard therapy, guided selection of antiplatelet therapy was associated with a reduction in major adverse cardiovascular events (RR 0·78, 95% CI 0·63-0·95, p=0·015) and reduced bleeding, although not statistically significant (RR 0·88, 0·77-1·01, p=0·069). Cardiovascular death (RR 0·77, 95% CI 0·59-1·00, p=0·049), myocardial infarction (RR 0·76, 0·60-0·96, p=0·021), stent thrombosis (RR 0·64, 0·46-0·89, p=0·011), stroke (RR 0·66, 0·48-0·91, p=0·010), and minor bleeding (RR 0·78, 0·67-0·92, p=0·0
030) were reduced with guided therapy compared with standard therapy. Risks of all-cause death and major bleeding did not differ between guided and standard approaches. Outcomes varied according to the strategy used, with an escalation approach associated with a significant reduction in ischaemic events without any trade-off in safety, and a de-escalation approach associated with a significant reduction in bleeding, without any trade-off in efficacy.
Interpretation: Guided selection of antiplatelet therapy improved both composite and individual efficacy outcomes with a favourable safety profile, driven by a reduction in minor bleeding, supporting the use of platelet function or genetic testing to optimise the choice of agent in patients undergoing PCI.
Lancet. 2021 Apr 17;397(10283):1470-1483.

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