基于扫描电化学显微镜技术研究细胞实时释放ROS
樊孝银;鲁理平;康天放
【摘 要】本研究利用扫描电化学显微镜(SECM)技术考察了十四烷酰佛波醇乙酸酯(PMA)刺激肺癌细胞(A549)活性氧物种(ROS)的实时变化.以过氧化氢(H2O2)为目标检测物,获得了细胞氧化应激的电化学响应图像.以氯化六氨基合钌(Ru(NH3) 6Cl3)为体系介质,利用电流负反馈技术获得细胞形貌的清晰图像,同时优化获得探针与基底之间的最佳检测距离.将探针电位设定为过氧化氢的还原电位(-0.65 V)时,通过电流成像图可观察到ROS实时释放,实现了A549细胞被PMA即时刺激时ROS释放的实时检测.扩大扫描区域,获得了不同个体细胞ROS释放的SECM图像,实现了SECM对ROS信号的实时捕捉及再现性.结果 显示:PMA可破坏细胞含氧物种的动态平衡,诱发细胞产生氧化应激响应.将探针放置在细胞ROS释放位点,检测其电流随时间变化,可观察到电流随时间呈现波动状态,推测ROS的胞外释放是一个动态的脉动过程.
【期刊名称】《分析测试学报》
【年(卷),期】2019(038)004
【总页数】6页(P379-384)
【关键词】扫描电化学显微镜(SECM);活性氧物种(ROS);H2O2;细胞
【作 者】樊孝银;鲁理平;康天放
【作者单位】北京工业大学环境与能源工程学院,北京 100124;北京工业大学环境与能源工程学院,北京 100124;北京工业大学环境与能源工程学院,北京 100124
【正文语种】中 文
【中图分类】O657.1;TQ460.72
活性氧物种(Reactive oxygen species,ROS)是需氧细胞在代谢过程中产生的一系列活性氧簇，包括：O2·-，HOO·，OH·，H2O2等[1-2]，在正常生理条件下，细胞内ROS的产生处于动态平衡状态[3]。然而，当动态平衡被打破时会造成氧化应激，导致大量ROS产生[4-5]，而且ROS的强氧化性可以引起细胞广泛的氧化损伤，从而导致细胞凋亡[6]。目前检测细胞ROS产生的方法有荧光测定法[7]、电子自旋共振法[8]、化学发光法[9]和流式细胞仪法[10]等。
但这些方法均存在不能实时检测活细胞中ROS的不足，如广泛使用的试剂盒方法(荧光测定法)存在对细胞浸入的潜在伤害作用，以及部分方法操作复杂等缺点。因此发展生理条件下检测细胞膜中实时释放ROS的分析技术对于探究生命体系受外界影响的机制至关重要。
佛波酯又称为十四烷酰佛波醇乙酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)，是一种可通过激活蛋白激酶PKC和NOXs来影响众多细胞生理过程的化合物。PMA是佛波酯类化合物中活性较高的一种，具有诱导多种肿瘤细胞分化的作用，生物学研究表明PMA能够诱发ROS的产生并触发癌细胞的凋亡[11]。
扫描电化学显微镜(SECM)是由Bard等于1989年提出的利用超微电极扫描得到法拉第电流对微区进行形貌以及电化学成像的一种显微新技术[12-13]。SECM的关键要素是超微电极，具有显著的灵敏度，短的响应时间和高的空间分辨率。尽管SECM起源于电分析表面科学，但在生物学应用和生物体研究方面也日益受到了人们关注。SECM在细胞研究中显示出独特的优势：①可无需探针-样本的接触即实现活体细胞直接检测；②只对有电活性的物质产生响应，选择性好；③单个细胞的表面形貌和局部反应可在高空间分辨率下进行研究。因此SECM在细胞水平上的研究具有无损伤性的独特优势[14-15]，适合研究活细胞中ROS的释放。
基于近年来SECM的发展及独特优势，其在单细胞分析上的应用也十分广泛[16-19]，利用不同的操作模式，可以分析细胞多个特征，尤其是SECM电流信号的变化能够反映细胞对外界刺激的变化，这为SECM在细胞水平上研究环境污染物的作用，以及环境毒理分析奠定了良好的基础，并对明确污染物产生的生物毒性机理提供了一定的依据。本研究利用ROS的稳定产物——H2O2具有电活性的特点，比较了PMA对肺癌细胞(A549)即时刺激前后ROS的变化，并通过SECM成像技术原位实时检测了PMA诱导A549细胞ROS的释放。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
扫描电化学显微镜CHI920D(SECM，上海辰华仪器有限公司)，倒置显微镜(日本奥林巴斯CKX41)，铂超微电极/探针(直径：10 μm)，铂丝对电极，Ag/AgCl参比电极(上海辰华仪器有限公司)；氯化六氨基合钌(Ru(NH3)6Cl3，美国Sigma公司)，1×PBS(上海生工生物科技有限公司)，过氧化氢(H2O2，30%)，十四烷酰佛波醇乙酸酯(PMA)，二甲基亚砜(DMSO)购于北京化学试剂有限公司；实验用水均为超纯水(1 018 Ω，美国Milli-Q超纯水系统)；A549细胞(北京工业大学生命科学与生物工程实验室);RPM 1640 培养基：4 ℃保存备用，使用时加入1
% 2 mmol/L的谷氨酰胺和10%的胎牛血清;PBS缓冲液、胰酶(美国Invitrogen公司);Opti-MEMI减血清培养基(美国Gibco公司)。
1.2 细胞培养
(1)将A549细胞的冻存管从液氮罐中取出，迅速放入 37 ℃水浴中，期间需晃动冻存管使其充分融化，直至冻存管中的物质基本融化。
(2)在超净工作台，向 15 mL 离心管中加入 5 mL RPM 1640 培养基，将冻存管中的液体(1 mL)加入 15 mL 离心管中，800 r/min 离心 5 min，离心管底部可见白沉淀。
(3)弃去上层液体，向离心管中加入 5 mL 1640 培养基，用移液器吹打混匀，转移至35 mm的细胞培养皿中，放入 37 ℃的 CO2(5%)培养箱中培养。
(4)细胞生长 24 h 后，更换细胞培养液1次。将培养好的细胞用于SECM实验。
1.3 SECM实验
将SECM与倒置显微镜结合，检测A549细胞释放ROS的示意图如图1所示。10 μm Pt超微电
极电位设定为 -0.35 V，在含有Ru(NH3)6Cl3的1×PBS溶液中做逼近曲线确定探针与基底间的距离，通过倒置显微镜观察细胞，在恒高模式下对细胞进行SECM的二维成像，扫描速度为50 μm/s。设置探针电位为 -0.65 V，在不含Ru(NH3)6Cl3的1×PBS溶液中并保持氮气气氛条件下检测ROS，利用SECM检测细胞的反馈电流，并进行二维成像扫描。
图1 SECM检测细胞外ROS的示意图Fig.1 Schematic representation of SECM for detection of extracellular ROS parameter：in a nitrogen-purged 1×PBS solution,10 μm Pt ultramicroelectrode, potential: -0.65 V
图2 空白基底上的SECM逼近曲线(黑)与SECM拟合逼近曲线(红)Fig.2 SECM experimental approach curves on dish (black)compared to simulated approach curves(red) parameter：1×PBS solution containing 1 mmol/L Ru(NH3)6Cl3,10 μm Pt ultramicroelectrode,potential:-0.35 V
reactive oxygen species (ros)
2 结果与讨论
2.1 细胞原位成像
细胞内的ROS通常由细胞内线粒体产生[6]，通过检测细胞外的ROS可反映细胞内ROS的释放，避免了探针对细胞造成的机械损伤。获取信号的探针与细胞之间的距离对于信号的灵敏采集至关重要。因此首先利用逼近曲线确定探针的空间位置，将盛有A549细胞的培养皿置于倒置显微镜载物台上，探针选择性的放置在无细胞的培养皿区域上方，并浸入含有1 mmol/L Ru(NH3)6Cl3的1×PBS溶液，施加 -0.35 V(vs.Ag/AgCl，Ru(NH3)6Cl3的还原电位)电位。探针尖端沿着垂直于水平方向逼近培养皿底部，在电极电流降低至I=0.75 I∞ 时，停止逼近，获得探针的空间高度。如图2所示，所得结果显示电流响应为负反馈模式[12,20]。图中黑实线为实验得到的逼近曲线，红虚线为模拟曲线，实验中探针电极的RG比为3。根据表格中参数以及公式(1)、(3)计算理论逼近曲线，式中，IT为探针尖端电流，IT,∞为探针离基底无穷远处时探针尖端的电流，a为UME探针尖端半径，d为探针-基底距离，do为从扫描第一点到基底表面的距离，dexp为探针距逼近起始点的距离。其中公式(3)的参数参照表1[21]。将实验所得的数据值绘制为I/I∞与L的函数并重叠理论逼近曲线，比较和分析差异。更改do值，直至到实际曲线和拟合曲线间的良好拟合。如图2，结合实验与模拟曲线拟合结果[21]，计算出探针尖端与基底间的实际距离d约8 μm。将此位置确定为探针与基底表面之间的检测距离[21]。
IT → I=IT/IT,∞
(1)
dexp →L=d/a=(do-dexp)/a
(2)
I=1/[A+B/L+Cexp(D/L)]
(3)
表1 不同RG值下等式(3)(负反馈)的参数值Table 1 Parameter values for equation(3)(negative feedback)at different RG valuesRGABCD10.20.404 721.601 850.588 19-2.372 948.130.426 761.460 810.568 74-2.285 485.090.486 781.177 060.512 41-2.078 733.040.604 780.860 830.395 69-1.894 552.030.761 790.609 830.238 66-2.032 67
图3 A549细胞的SECM成像图 Fig.3 SECM image of A549 cells parameter：1×PBS solution containing 1 mmol/L Ru(NH3)6Cl3,10 μm Pt ultramicroelectrode,potential: -0.35 V
其后通过显微镜观察，将探针水平定位至细胞区域上方，探针电位设置为-0.35 V，在含有1 mmol/L(Ru(NH3)6Cl3)的1×PBS溶液中，保持检测距离8 μm，通过SECM的恒高模式对细胞进行二维扫描成像。获得的SECM图像如图3所示，图中水平范围为80×80 μm，不同颜表示所得到的电流大小不同。从上部的二维图像可明显看出扫描区域内有3个椭圆形的细胞(坐标X/Y：33～57/13～38)、(坐标X/Y：20～43/36～65)、(坐标X/Y：42～80/ 65～80)，依次呈绿、黄和红，表示所测得的反馈电流逐步增大，结合下方的三维图像可知细胞的形貌接近橄榄球体。通过测定反馈电流大小得到细胞形貌的原理是因为亲水性物质Ru(NH3)6Cl3不能穿透疏水性细胞膜[22]，细胞表面为电化学惰性底物，细胞与探针顶端之间的极小空间阻碍了Ru(NH3)6Cl3向探针的扩散，且细胞具有一定的高度，导致电流降低。因此，在二维扫描期间IT的减少归因于探针与细胞距离的减小，也对应于细胞高度的增加。
图4 不同浓度H2O2的差分脉冲伏安曲线Fig.4 DPV curves of different concentration of H2O2cH2O2(a-c):0,2,4 mmol/L；detection system：1×PBS solution after deoxygenation
2.2 检测条件的优化
探针电位的准确设置对于ROS检测的灵敏度至关重要。为了优化本体系检测ROS探针的施加
电位，利用差分脉冲伏安法(DPV)获得不同浓度H2O2的电化学响应，检测介质为通氮除氧处理的1×PBS溶液，且检测过程保证氮气氛围，所得结果如图4所示。图中可观察到，未加入H2O2时体系所测的DPV曲线无电化学响应(曲线a)；依次对含2 mmol/L和4 mmol/L H2O2的体系进行DPV扫描(曲线b、c)，可观察到在-0.65 V处有1个明显还原峰，且随着浓度增大，还原峰电流增强。通过与文献比对[22]，确定此峰为H2O2的还原峰。因此，最终确定SECM实验中探针电位设为-0.65 V。

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