线粒体异常的表现及其检测
线粒体具有自我复制、转录和编码功能。被称为“能量工厂”的线粒体, 人体至少有90%的能量由其产生[ 1] 。在人体各个细胞都存有线粒体, 单个细胞包含200 ～ 2000个线粒体, 但是不同组织的细胞内线粒体的数量是不同的, 而在相同组织的细胞内线粒体数量是接近的[ 2] 。
1.线粒体基因损伤
    在人类, 线粒体DNA(mtDNA)是长16 569 bp的闭合双链环状分子, 每个mtDNA分子编码13个氧化磷酸化蛋白亚单位, 2 个与这些基因翻译有关的rRNA(12SrRNA和16SrRNA)和22个转录RNA, 其中这13个亚单位与核DNA编码的其他亚单位共同组成呼吸链。此外, 还含有一段与mtDNA复制、转录有关的非编码区(D环区)。由于缺少组蛋白的保护与有效的校读系统, mtDNA极易受到氧化磷酸化过程中产生的活性氧(reactiveoxygenspecies, ROS)
的损害而突变, 其突变率较DNA高10 ～ 100 倍[ 3] 。
   
2.线粒体功能损伤及检测
2.1RCR检测
  测定RCR既可以反映线粒体的完整程度, 又可以反映线粒体氧化呼吸链的功能。线粒体氧化呼吸链系由一系列的递氢体和递电子体按一定的顺序排列组成的连续反应体系, 代表着线粒体的最基本功能, 可以通过RCR来测定其线粒体外膜及功能完整性和氧化磷酸化效率, RCR为加入ADP时(Stage3)的呼吸速率与ADP耗竭后(Stage4)的呼吸速率之比。线粒体的呼吸耗氧耦联着ADP与Pi合成三磷酸腺苷的磷酸化反应, ADP/O值是指线粒体每消耗1 mol氧原子的同时, 生成ATP的摩尔数。RCR通常与ADP/O比值一起, 成为衡量线粒体结构完整与否及氧化磷酸化耦联程度的灵敏指标, 在线粒体氧化呼吸链功能受损的情况下, S3值、RCR、ADP/O比值下降, S4值则显著升高。一般使用氧电极法检测, 该方法要求待测定的线粒体是新鲜的, 否则所得数据会发生很大误差[ 11] 。
2.2　MAPR　
MAPR的测定也可以作为评价线粒体呼吸链功能的一项指标。该法是建立在ATP与重组荧光素酶及底物荧光素反应的基础之上, 但是敏感度较低, 而且每次检测需要0.5 ～ 1.0 g的骨骼肌作为标本, 这样导致临床取样时损伤较大。之后Wibom等[ 12]采用一种改良的发光技术检测
MAPR,该法比最初的方法敏感度要高50%～ 220%, 而且每次检测只需25 mg的骨骼肌标本。采集的样本迅速用差速离心法将线粒体分离出后, 用生物发光技术对最终的部分线粒体悬液进行MAPR检测。反应混合物包括荧光素-荧光素酶ATP检测试剂等。检测MAPR时通常选取骨骼肌作为样本, 随着技术的不断改良, 现在已经广泛应用于医学、生理学、毒理学等领域的研究[ 13-15] 。
2.3　离子通道的检测　
线粒体渗透转换孔是横跨在线粒体内外膜之间非选择性高导电性通道, 通常保持关闭状态, 是线粒体渗透转换功能的基础。线粒体渗透转换孔对环孢素有较高的敏感性, 对细胞内外多种离子浓度变化非常敏感, 特别是对在细胞内信号转导系统有重要作用的钙离子浓度的变化非常敏感, 可因钙超载或ROS生成而被诱发开启。线粒体渗透转换孔转换孔大量开启能引起膜电位崩解并导致细胞凋亡。线粒体渗透转换孔的检测方法有活性物质标记法、膜片钳法、分光光度法等, 其中分光光度法较为简单易用。
4.4　膜电位的检测　
Chu等[ 16] 曾用激光共聚焦检测大鼠肠黏膜细胞线粒体跨膜电位变化, 该法采用线粒体跨膜电位检测试剂盒(JC-1)。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位ΔΧm的理想荧光探针。
可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时, JC-1聚集在线粒体的基质中, 形成聚合物, 可以产生红荧光;在线粒体膜电位较低时, JC-1不能聚集在线粒体的基质中, 此时JC-1为单体, 可以产生绿荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。Lim等[ 17] 用四苯膦等脂溶性阳离子渗透入线粒体膜基质, 然后通过检测四苯膦的浓度来确定膜电位, 需要注意的是此法在检测过程中对溶液pH值的稳定性要求较高, 否则将影响实测值。膜片钳技术是一种以记录通过细胞膜上的各种离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一或多个离子通道活动的技术, 其反映的电流特征可以用来评价线粒体功能。全自动膜片钳技术效率高, 是传统膜片钳技术的20～ 300倍, 操作技术简单;缺点是仅适用于悬浮细胞的
检测[ 18] 。线粒体膜是线粒体与周围环境联系、反应的桥梁, 膜磷脂含量与流动性的改变与疾病的发生、发展密切相关。脂质过氧化作用可以导致膜磷脂的减少, 线粒体膜磷脂的检测对判断线粒体功能具有重要意义[ 19] 。
3.线粒体形态学损伤及检测
  20世纪60 年代初, Engel等[ 20]首先用MGT染发现线粒体肌病患者肌膜和肌纤维之间呈不规则的红染颗粒改变, 称为粗糙红纤维, 为线粒体肌病具有特征性的形态学改变。宋东林等[ 21] 曾用电镜观察线粒体肌病时发现在骨骼肌肌膜下线粒体异常增多, 并有巨大畸形线粒体出现,线粒体嵴型异常, 可呈同心漩涡状、迷宫状或矩形结晶状结构。姚英民等[ 22] 曾用电镜观察轮状病毒感染时线粒体形态变化时发现线粒体外形肿胀, 电子密度增高, 基质中在大量具有紊乱的峭和晶状物, 峭模糊不清, 基质凝集。
3.1　有氧前臂运动试验　
线粒体肌病患者因骨骼肌线粒体氧化磷酸化受损, 致使无氧代谢增加, 引起血浆乳酸水平增高。Taivassalo等[ 23] 在2002 年发现, 有氧前臂运动试验是一种新的、敏感的检测骨骼肌氧化代谢能力的方法, 并观察到与健康人比较,运动前线粒体肌病患者的血氧饱和度(SO2 )reactive oxygen species (ros)和血氧分压(PO2)明显降低。陈健华等[ 24] 对42例线粒体肌病诊断明确患者行此试验。试验前, 所有受试者需在运动侧肘正中静脉置管, 受试者需在运动前、运动结束前30 s、运动后10 min取血, 分别检测其PO2 、SO2 、pH、血液乳酸等, 发现在运动中, PO2 和SO2 的变化与
细胞氧化代谢能力损伤的程度呈正相关, PO2下降越少, SO2 下降幅度不明显反而升高, 说明病情越重。运动前(或运动中)pH较低、运动前血乳酸水平高于正常亦提示线粒体有异常的可能, 而且研究表明该方法较肌肉活检更敏感。
3.2　磁共振诊断与波谱分析　
Morava等[ 25] 曾建立一个线粒体疾病综合评分系统, 用于诊断疑是线粒体疾病患者。该系统是对包括临床症状、体征, 代谢、影像学、病理学改变等多方面因素进行综合评价, 其中磁共振诊断与波谱分析起着重要的作用, 因为属于非侵入性检查, 特别对于儿童, 有良好的依从性。后二者的结果将决定是否进行下一步检查, 如分子分析、病理活检等。黄文才等[ 26] 曾观察7 例线粒体脑肌病伴高乳酸血症与卒中样发作事件脑内卒中样病灶的磁共振成像表现, 发现在超急性期(3 d内)以细胞毒性水肿为特征, 呈边界清楚的高信号灶。1H磁共振波谱进行分析时发现脑卒中样病变在早期以高耸的双乳酸峰为特征。故认为磁共振成像和磁共振波谱对评价卒中样发作具有重要价值。
4.总结与展望
  在疾病早期, 线粒体功能的改变往往先于临床症状出现。因此, 对于线粒体结构及功能的检测可以及时察觉其功能的改变并做相应的处理, 可以阻止或延缓疾病的进一步发生、发展。虽然现在有多种方法用来可以检测线粒体的功能, 但是由于工作人员的操作技能、所涉及仪器的运行环境、成本、效率等多方面的限制, 目前绝大多数方法仅局限于科研, 距离真正的临床实际应用仍然有很长的路要走。

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