基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第10期，第4475-4480页
研究报告
Research Report
低温驯化对斑马鱼Z F4细胞凋亡和R O S的影响
王晓煜li3胡春兰4程鹏丽w陈良标以
1上海海洋大学，水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海，201306; 2上海海洋大学，中国科学技术部，海洋生物科学国际联合研究中 心，上海,201306; 3上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海,201306; 4上海市公共卫生临床中心，上海,201306
*通信作者，丨**************
摘要低温驯化是生物适应寒冷环境的一个重要途径，了解低温驯化的机制对揭示生物如何在低温环境中存活并繁衍具有重要的意义。为了探宄鱼类适应低温的机制，本研究建立了斑马鱼成纤维Z F4细胞的单克隆细胞系，并在18°C长期培养适应16个月，成功获得了低温驯化细胞系。之后我们将18°C驯化组细胞和28°C未驯化组细胞放置I3°C低温处理3d后，观察低温对驯化细胞和未驯化细胞的影响。我们发现18
°C驯化细胞的形态与18°C〜13°C 3 d处理组没有明显差别，并且细胞能正常生长，稳定传代，说明驯化后的细胞对低温己经产生了适应性。随后我们比较了18°C低温驯化组和28°C未驯化组的细胞形态发现，在13°C处理3d 后，驯化组细胞连接较为紧密，整体状态未发生太大变化；而28°C未驯化组细胞聚集程度非常明显，细胞状态较差，死细胞数目增多。我们对细胞的存活率，活性氧(reactive o x y g e n species,R O S)含量及细胞的凋亡程度进行检测发现，18°C驯化组细胞存活率高于28°C未驯化组(p<0.05),R O S含量显著低于28°C未驯化组(；>< 0.01)，凋亡程度显著低于未驯化组(p<0.01)，说明低温驯化能提高细胞的耐寒能力，在面临更低温度时，能减少R O S含量减轻细胞受损程度。总之，本研究成功建立了低温驯化细胞系，为今后抗寒机制的研究提供了实验材料，同时也为低温适应机制的进化历程追踪提供了研宄基础。
关键词Z F4单克隆细胞，驯化，凋亡，R O S
Effects of Cold Acclimation on the Apoptosis and ROS of Zebraflsh ZF4 Cells
W a n g X i a o y u 1,2,3H u C h u n l a n4C h e n g Pengli123C h e n Liangbiao
1Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Shanghai, 201306; 2 International Research Center for Marine Biosciences at Shanghai Ocean University, Ministry of Science and Technology, Shanghai, 201306, 3 National Demonstration C
enter for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai, 201306; Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai, 201306
*Correspondingauthor,***************
DOI: 10.13417/j.gab.039.004475
Abstract L o w temperature acclimation is an important w a y for organisms to adapt to the cold environment.L o w temperature acclimation is of great significance for revealing h o w organisms survive a n d reproduce in l o w temperature environments.In order to explore the m e c h a n i s m of fish adaptation to l o w temperature,this study established a monoclonal cell line of zebrafish fibroblast Z F4cells,a nd cultured at18°C for16 m o n t h s, successfully obtained a l o w temperature domestication cell line.T h e n,w e placed18°C domesticated cells a n d 28〇C u n a c c o m p a n i e d cells at 13°C for 3 days,a n d observed the effects o f l o w temperature o n domesticated a n d non-domestic cells.W e found that the m o r p h o l o g y of domesticated cells at 18°C w a s not significantly different from that o f the 18°C〜13°C—3 d treatment group,a n d the cells g r e w normally a nd stably passaged,indicating that the domesticated cells had adapted to l o w temperature.Subsequently,w e c o m p a r e d the cell m o r p h o l o g y o f the
基金项目：本研究由国家自然科学基金面上项目(31572611)资助
引用格式：Wang X.Y., Hu C.L., Cheng P.L., and Chen L.B., 2020, Effects of cold acclimation on the apoptosis and ROS of zebrafish ZF4 cells, Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology), 39(10): 4475-4480 (王晓煜，胡春兰，程鹏丽，陈 良标，2〇2〇，低温驯化对斑马鱼ZF4细胞凋亡和ROS的影响，基因组学与应用生物学,39(10): 4475-4480)
4476基因组学与应用生物学
acclimation group a n d the 28 C u n a c c o m p a n i e d g r o u p.After three days of treatment at13 C ,the cells in the acclimated group w e r e tightly connected,a n d the overall state did not change a lot.H o w e v e r,the cells w e r e not acclimated at 28〇C.T h e degree is very obvious,the cell state i s poor,and the n u m b e r o f dead cells i s increased. W e found that the survival rate of cells,the content o f R O S and the degree of apoptosis of cells s h o w e d that the survival rate o f cells in the domesticated group at 18°C w a s higher than that in the u n a c c o m p a n i e d group at 28〇C (/><0.05), a n d the R O S content w a s significantly lo w e r than that in the u n a c c o m p a n i e d group at28〇C (/><0.01), the degree of apoptosis w a s significantly lower than that of the non-domestic group (/)<0.01 )，indicating that low temperature acclimation can increase the cold tolerance
of cells,and reduce the R O S content to reduce the degree of cell d a m a g e in the face o f lower temperature.In conclusion,in this study,through establishing a low temperature domestication cell line,i t w a s provided experimental materials for the future research o n the m e c h a n i s m o f cold resistance,a nd also provided a research basis for the evolution o f the low temperature adaptation m e c h a n i s m.
Keywords Z F4 m o n o clonal cells,Acclimation,Apoptosis,R O S
冷驯化是生物体为了克服低温带来的负面影响，进化出一种自我适应的反应(Gilmour et al.，1988; T h o m a s h o w，1999)。也就是说，冷适应使有机体能够在低于原有的生存温度范围下生存。南极鱼类(Afe- 是非常典型的冷驯化例子，经过数百万年在寒冷而稳定的温度下进化，从而在0°C以下的水域繁衍生息(1366^311£1』3>^1^(13以，2015)。这种环境造成了南极鱼类对冰冻条件的适应性，同时优化了整体的功能，包括能够保持异常寒冷体温下的生殖、感知和运动功能(H u b o l d, 1993; W i l s o n et al.，2002; N e a r et al.，2012)。
研究者发现南极鱼适应冰冷环境是因为体内的抗糖蛋白或抗冻蛋白(D e n g etal.，2010)，抗冻蛋白是在许多生活在0°C以下的不同生物体中进化而来的(Barrett, 2001; D u m a n，2001)。这一发现带给我们很大启发，驯化能提高生物的适应性，维稳生理机制，降低胁迫带来的损伤。活性氧(reactive oxygen spe
cies, R O S)和凋亡作为应激反应复杂信号网络中的关键成员，在生物体内的很多信号转导以及维持内环境稳定等调控方面起着重要作用。
己有研究表明低温可诱导水生生物氧化应激，低温压力下，R O S的含量会显著上升，进而造成细胞结构性损伤(D e v a s a g a y a m et al.，2004)。低温引起的应激不仅会导致氧化损伤，还可能引起细胞凋亡(C h e n g etal.，2017)。H u等(2016)揭示了不同时间处理冷应激下，斑马鱼和罗非鱼细胞凋亡程度，从转录组角度分析调节凋亡代谢网络关系。因此我们通过R O S和凋亡的检测反映驯化的效应。驯化能否减少R O S引起的损伤，降低凋亡程度是我们研宄的主要问题。
在自然界中鱼类经常受到温度季节变化的影响，而大多数鱼类的死亡都是来源于水温低于物种
特有的生存范围(Beitinger et al.，2000; Donaldson et al.，2010; L d p e z-O l m e d a a n d S t o c h e z-Vftzquez，20〗1)。大 量具有重要商业价值的水产养殖物种，如罗非鱼(Oreochromis niloticus)^ ?LA{Chanos chanos)^Q
觸(Pflgm.s等对寒冷胁迫敏感，冬季冷潮来临时
往往导致大量死亡(K u o a n d Hs i e h,2006; Zerai et al., 2010)。因此，研究鱼类冷驯化对科学研究和渔业生产也具有重要意义。
因此，本研宄将斑马鱼成纤维Z F4细胞筛选单克隆培养形成细胞系，之后将其长期处于18°C低温培养16个月后从第一代传至45代，使之驯化产生对低温的耐受性。随后将驯化细胞和未驯化细胞再处于13°C更低温的环境下，观察比较细胞的状态及损伤程度，通过检测驯化细胞与未驯化细胞的存活率，凋亡和R O S，探究了低温驯化对细胞耐寒能力的影响，以期为生物的寒冷适应性进化提供研究基础。
1结果与分析
1.1细胞形态学分析和存活率统计
18°C低温驯化的细胞从第一代传至第45代 (图1A)。第一次传代，细胞贴壁效率较低，死细胞较多。随着传代数的增加，细胞贴壁速度加快，死细胞变少，并能稳定生长。说明细胞经过低温驯化后达到了对低温的适应性。比较18°C低温驯化细胞和28°C 未驯化细胞对低温的耐受性，从细胞形态学观察发现(图1B)，正常细胞即28°C未驯化细胞形态较小，形 态规整均一，核质颜较深。比较28°C与28°C转至13°C处理3 d发现，13°C处理后细胞明显呈大幅度聚集状态，细胞“成堆”生长，细胞状态较28°C正常细胞
低温驯化对斑马鱼ZF 4细胞凋亡和ROS 的影响 4477
H  n n n 28°C 28°c-13°c 18°c-13°c 18°C -3d -3d
C
图1细胞形态观察和存活率统计
注:A: ZF4单克隆细胞在18°C 驯化的过程;B ：左上角：对照组即正常温度28°CZF4单克隆细胞；左下角：对照组在13°C 培养3 d; 右上角：18°C 驯化的单克隆细胞；右下角：驯化细胞在13°C 培养3 d: C•不同条件下细胞存活率统计，图中所示为均值±标准误， 数据来自至少3次独立的生物学重复;***：未驯化组与对照组差异极显著(^<0.001); *：驯化组与未驯化组相比差异显著(^<0.05)， 驯化组与驯化处理组相比差异显著(/><0.05)，驯化组与对照组相比差异显著(；)<0.05)
Figure 1 Observation of cell morphology at different conditions
Note: A: ZF4 monoclonal cells acclimated at 18°C; B: Upper left comer: Control group is normal ZF4 monoclonal cells at 28〇C; Lower left comer: Control group cultured at 13°C for 3 days; Upper right comer: Domesticated single cloned cells at 18°C; Lower right cor ner: domesticated cells cultured at 13 °C  for 3 days; C: Cell viability statistics under different conditions, data shown are the means±standard deviation of at least three independent experiments; ***: Denotes significant differenc
es between un-acclimated group and control group (p<0.001); *: Cells of survival rate were significant differences acclimated group compared with the un-acclimated group (/><0.05), acclimated group compared with the acclimated treat group («<0.05), acclimated group compared with the control group (〇<0.05)
差，培养基漂浮的死细胞较多；比较在18°C 低温驯化 后细胞与18°C 转至13°C 处理3 d 发现，低温处理组 细胞较紧密的连接生长，细胞状态略差于18°C 驯化 细胞。其次，比较28°C 正常细胞和丨8°C 驯化细胞发 现，驯化细胞形状较28°C 未驯化细胞大，核质较浅。 28°C ~13°C -3 d 对比18°C 〜13°C -3 d 发现，前者聚集 更明显，细胞状态更差。表明驯化细胞在13°C 更低温 度下，细胞能较快适应低温环境，维持细胞正常形态 并正常生长。对四组细胞存活率检测发现,28°C 未驯 化组细胞存活率高于18°C 低温驯化组{p <0.05),28°C 〜 13°C -3 d 细胞存活率极显著低于28°C 未驯化组(；,<
0.001), 18°C 〜13°C -3 d 细胞存活率低于18°C 驯化组 〇><0.05),28°C ~13°C -3 d  组细胞存活率低于 18°C ~ 13°C -3 d 组b <0.05)(图1C )。表明低温驯化细胞处于 比原来温度更低的环境下细胞活力变化不大，死亡 率较低；而未驯化的细胞处于更低温度下，细胞活力 显著下降，死亡率显著升高。1.2 ROS 检测低温刺激会引起细胞内R O S 积累。R O S 检测发
现（图2A ),28°C 未驯化组与28°C -13°C -3 d 处理组
相比，处理组R O S 含量极显著高于28°C 未驯化组 0<〇.〇丨）。18°C 低温驯化组与18°C -13°C -3d 处理组相比，R O S 含量无显著性差异。18°C -13°C -3d 处理组 R O S 含量极显著低于28°C -13°C -3 d 处理组h <0.01) (图2B )。由于驯化组对低温的适应性导致细胞提高 了耐寒能力，因此18°C 低温驯化组与18°C -13°C -3 d 处理组细胞内R O S 含量无明显差别。18°C 低温驯化 细胞与28°C 未驯化细胞比较结果表明了经低温的驯 化细胞显著提高了对寒冷的适应性，未驯化细胞对 低温刺激比较敏感，细胞内大量释放R O S ，从而对细 胞造成极大损伤。
1.3凋亡检测
用流式细胞仪检测18°C 低温驯化组与28°C 未 驯化组的细胞凋亡程度(图3A ；图3B >，结果显示：在 13°C 低温处理3 d 后，28°C ~13°C -3 d 低温处理组的 早期凋亡和晚期凋亡比例均显著高于28°C 未驯化组 (/k O .OI ), 18°C 低温驯化组与18°C 〜13°C -3 d 低温处理 组相比，二者细胞凋亡数目没有显著性差别(/,>0.05)。
以上结果表明18°C 低温驯化组细胞适应低温的能力
较强，细胞的凋亡程度较小。
2讨论本研究通过对斑马鱼成纤维Z F 4细胞在18°C 低 温驯化16个月，成功建立了 Z F 4低温驯化细胞系,
B
2«
>
A J n c /3
,^
1
4478 基因组学与应用生物学
图3流式细胞术检测细胞凋亡
注:A: U L 表示死细胞；LL 表示活细胞；U R 表示晚期凋亡;L R 表示早期凋亡；B ：早期凋亡和晚期凋亡细胞百分数统计，未驯化 组与对照组对比，未驯化组凋亡极其显著(pcO.OOl)；驯化实验组与未驯化组对比，未驯化组凋亡显著(/,<0.01)
Figure 3 Cell apoptosis by flow cytometry
Note: A: UL denotes death cells; LL denotes living cells; UR denotes late apoptosis cells; LR denotes early apoptosis cells; B : Statistics of early apoptosis and late apoptosis under different conditions, compared with the control group, the apoptosis in the undomesticated group was extremely significant differences (n<0.001); Compared with the undomesticated group, the apoptosis in the undomesticated group was significant differences (/xO.Ol)
比较了低温驯化细胞与28°C 正常细胞即未驯化细胞 在13°C 更低温度环境下，细胞存活率，R O S 含量及 细胞凋亡程度的影响，也从形态学角度观察细胞耐 低温的表现。斑马鱼幼鱼在低温16°C 适应24 h 后， 进一步在12°C 更低温胁迫，幼鱼的存活率显著提高， 从转录组角度更明确解释了斑马鱼在温和低温下建
立耐寒能力(Long  etal ., 2013)。我们从细胞形态上分
析18°C 低温驯化组和28°C 未驯化组发现，经过13°C
处理3d 后，低温驯化组细胞与细胞之间呈连接状 态，细胞的状态没有较明显变化，而未驯化细胞呈 “抱团”现象，与对照组相比，细胞状态较差，18 °C 低 温驯化组细胞的存活率高于28°C 未驯化组，以上这 些现象说明驯化细胞比未驯化细胞更加适应相对较 低温的环境。
低温胁迫可导致内源性活性氧(R O S )增加，如羟 基自由基、超氧自由基、过氧化氢自由基等。当R O S 的产生过多超出机体处理的能力时，就会产生氧化 应激(Lesser , 2006; A n  and  Choi , 2010)。氧化应激可
损伤重要的生物分子，
如D N A 、蛋白质和脂质(513也- m a n  and  Levine , 2003)。驯化细胞和对照组低温13°C 处理3 d ，驯化实验组R O S 含量明显低于未驯化组, 因此细胞的状态比未驯组好。R O S 会使D N A 链断裂，导致D N A 损伤。当细 胞受到D N A 损伤和生长因子缺失等应激刺激时，都 会引起细胞凋亡(Mai  etal .，2010>。近来的研究表明，线 粒体膜电位下降在线粒体介导的细胞凋亡中起重要作 用。细胞受到外界刺激会释放凋亡因子，促使线粒体 膜上聚集大量的促凋亡蛋白，因而膜通透性转化孔开 放，使内膜离子梯度消失、导致线粒体膜电位降低或耗
散，促进凋亡活性物质释放进入胞质，激活Caspase 级联反应最终导致细胞发生?
周亡(Cao  et  al .，2005)。当细胞对低温形成一定的适应性，减少凋亡的
28°C
(PI in all)18°C Gate: (PI in all)! 400
'200uno 2 丨 O M O M O M O * 107:FL! A 1 200 0280C-13°C 3 d Gate: (PI in all)________
lO 'H m 'lO M O M O 6 10，：V l-R  99.80，丨：400 1 200 0u i i io ，um , io ”o , io 6 丨〇，-、  6.0 i g 4.8
S i
3.6*1
g  g  2.4 1.2
0.0lO 'lO -'lO M O M O M O 6 10':28°C D n 28°C 13°C  18X'-13°C 3d -3d
B 18°C
图2不同条件下细胞ROS 含量的变化
注：A ：流式细胞术检测活细胞的ROS 相对强度；B: ROS 含量统计，未驯化组R O S 含量高于对照组(/,<0.05)，驯化组RO S 含 量显著低于未驯化组(/,<0.01)
Figure 2 Changes of cellular ROS content at difTerent conditions
Note: A: Flow cytometry to detect the relative intensity of ROS in living cells; B: ROS content statistics, the ROS content in the non-acclimation group was higher than that in the control group (/><0.05), the ROS content in the domesticated group was significantly
higher than that in the non-acclimation group (/；
<0.0!)f o o  o  o  o  o 0
8 6
4
2
(％) l l s
1®仨2 3q
i
发生。驯化组与对照组比较发现，二者凋亡显著性不 明显，细胞能在18°C正常生长，稳定的传代，细
胞的 生理机制己经产生了对寒冷的免疫，或者说，已经把 18°C的温度环境当成细胞的正常生存温度，这一现 象和极地鱼类的生活环境非常相似。
综上所述，低温驯化细胞能提高细胞的存活率，减少R O S含量的积累，降低细胞凋亡程度，提高了 细胞面临低温的适应性，进一步增加了抵御寒冷的能 力。极地鱼类长期寒冷环境的适应成功运用到细胞 实验中，为鱼类的冷适应提供了突破点，但在细胞冷 适应过程中，生物如何维持机体R O S含量的平衡，调控促凋亡和抗凋亡蛋白的表达量如何决定细胞生 存的命运，其具体的分子调节网络和机制有待阐明。
3材料与方法
3.1主要材料与试剂
细胞系：斑马鱼Z F4细胞系(胚胎发育3 d成纤 维样细胞)购于美国 A T C C(American type culture collection)。Trizol Regent购自上海颜挚生物技术公 司；D C F H-D A活性氧检测试剂盒购自Beyo t i m e公司；Annexin V-F1T C ?周亡检测试剂盒购自V a z y m e 公司；增强型C C K-8试剂盒购自Beyotime公司。
3.2实验方法
3.2.1细胞培养
Z F4细胞梯度稀释获得单个细胞，单细胞扩大培 养形成细胞系称Z F4单克隆细胞系。细胞完全培养 基的配制按照基本培养基(Hyclone公司，美国）、1% 双抗、15%胎牛血清89:1：丨5的比例，配制完成后充分 混匀储存于4°C备用。Z F4单克隆细胞的培养采用 D M E M F12/1:1 培养基，培养条件为 28°C,18°C,13°C, 5%C02，95°/。湿度，细胞均放于培养箱(Galaxy丨70R, Eppendorf公司，德国)中培养。将Z F4单克隆细胞长 期低温18°C培养长达16个月，使细胞能够在18°C温 度下，正常生长，稳定传代，进而形成低温驯化细胞。驯化实验组为驯化18°C细胞放置13°C处理3 d，未 驯化组为28°C正常细胞放置13°C处理3d，驯化组为 长期培养的18°C细胞；对照组正常温度28°C细胞。
3.2.2存活率检测
存活率检测：96孔板中每孔均接种2 000个细 胞，实验组和对照组分别处理3 d后。弃掉原有培养 基，每孔加入10 p L增强型C C K-8溶液和100 |jl L 的细胞培养液，用加了相应量细胞培养液和增强型
低温驯化对斑马鱼ZF4细胞凋亡和ROS的影响 4479
C C K-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。在 原来的温度培养箱内继续孵育I h。用酶标仪进行 性检测。
3.2.3流式细胞仪检测R O S
细胞内R O S检测：将处于对数生长期的Z F4单 克隆细胞接种于80 m m小皿中，实验处理后，弃上层 培养基，用1m L D P B S洗涤细胞2次，500 p L不含 E D T A胰酶消化（时间不宜过久；影响后续探针进入 细胞)，加1m L吹打，得到悬浮细胞，将悬浮细胞移 至1.5m L的E P管，用无血清的细胞培养基洗涤2次，加入1m L D C F H-D A(10|xmol/L)工作液，避光，在 37°C细胞培养箱放置30 min(隔2〜3m i n轻轻晃匀)，离心去除D C F H-D A工作液，用无血清细胞培养液洗 涤细胞3次，用500 (xL P B S重悬细胞，B D Accuri C6 流式细胞仪进行检测。
3.2.4流式细胞仪检测凋亡
细胞凋亡检测：用不含E D T A的胰酶消化后，800 r/m i n，4°C离心5 m i n收集细胞。用预冷的P B S 洗潘2次，每次均在800 r/m i n，4°C离心5 m i n。加入 100 (j l L lxBinding Buffer重悬细胞，实验组均加入 5 |xL Annexin V-FITC 和 5 jxL PI Staining Solution，对照组分别单染，双染，轻轻混匀。避光，室温反应 10 m i n，加入 400 jxL lxBinding Buffer，轻轻混匀，用流式B D Accuri C6流式细胞仪检测分析。
3.2.5统计学处理
实验数据采用GraphPad Prism5软件进行分析，做图采用/检验检测不同样品间的差异显著性(•><0.001，差异极显著；><0.0丨，差异显著，7,<0.05，有差异)。
作者贡献
陈良标为项目负责人；王晓煜负责实验设计、进 行及论文撰写；程鹏丽协助实验完成及数据处理；胡春兰指导实验设计。全体作者都阅读并同意最终 的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金面上项目（315726- 11)资助。
参考文献
An M.I., and Choi C.Y., 2010, Activity of antioxidant enzymes
4480基因组学与应用生物学
and physiological responses in ark shell, Scapharca broughtonii, exposed to thermal and osmotic stress: effects on hemolymph and biochemical parameters, Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol., 155(1): 34-42
Beers J.M., and Jayasundara N., 2015, Antarctic notothenioid fish: what are the future consequences
of'losses' and 'gains' ac­quired during long-term evolution at cold and stable tempera­tures, J. Exp. Biol., 218(12): 1834-1845
Beitinger T.L., Bennett W.A., and Mccauley R.W., 2000, Tem­perature tolerances of north-american freshwater fishes ex­posed to dynamic changes in temperature, Environ. Biol.
Fish., 58(3): 237-275
Barrett J., 2001, Thermal hysteresis proteins, Int. J. Biochem.
Cell Biol., 33(2): 105-117
Cao W., Collins Q.F., Becker T.C., Robidoux J., Lupo E.G., and Xiong Y., 2005, P38 mitogen-activated protein kinase plays
a stimulatory role in hepatic gluconeogenesis, Int. J.
Biochem. Cell Biol., 280(52): 42731-42737
Cheng C.H., Ye C.X., Guo Z.X., and Wang A丄.，2017, Immune and physiological responses of pufferf
ish (Takifugu obscurius) under cold stress, Fish and Shellfish Immun., 64: 137-145 Donaldson M.R., Cooke S.J., Patterson D.A., and Macdonald J.S., 2010, Cold shock and fish, J. Fish Biol., 73(7): 1491-1530 Duman J.G., 2001, Antifreeze and ice nucleator proteins in terres­trial arthropods, Annu. Rev. Physiol., 63(63): 327-357 Deng C., Cheng C.H.C., Ye H., He X. and Chen L., 2010, Evolu­tion of an antifreeze protein by neofunctionalization under escape from adaptive conflict, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107(50): 21593-21598
Devasagayam T.P.A., Tilak J.C., Boloor K.K., Sane K.S., and Lele R.D., 2004, Free radicals and antioxidants in human health: current status and future prospects, J. Assoc. Physi­cians India, 52(794804): 794-804
Gilmour S.J., Hajela R.K., and Thomashow M.F., 1988, Cold ac­climation in A rabidopsis thaliana^ Plant Physiol., 87(3): 745-750 Hu P., Liu M., Liu Y., Wang J., Zhang D., Niu H., Jiang S., Wang J., Zhang D., Han B., Xu Q., and Chen L., 2016, Transcrip- tome comparison reveals a genetic network regulating the lower temperature limit in fish, Sci. Rep., 6: 28952
Hubold G., 1993, Antarctic fish biology: evolution in a unique
environment, by J.T. Eastman, Polar Record, 30(172): 1-3 Lopez-Olmeda J.F., and Sanchez-Vazquez
F.J., 2011, Thermal biology of zebrafish (Danio rerio),J. Therm. Biol., 36(2): 91-104
Kuo C.M., and Hsieh S丄.，2006, Comparisons of physiological and biochemical responses between milkfish (Chanos chanos) and grass carp (Ctenopharyngodon idella) to cold shock, Aquaculture, 251(2-4): 525-536
reactive oxygen species (ros)Long Y., Song G.L., Yan J.J., He X.Z., Li Q., and Cui Z.B., 2013, Transcriptomic characterization of cold acclimation in larval zebrafish, BMC Genomics, 14: 612
Lesser M.P., 2006, Oxidative stress in marine environments: bio­chemistry and physiological ecology, Annu. Rev. Physiol., 68(1): 253-278
Liang L.Q., Chang Y.M., and He X.L., 2015, Transcriptome anal­ysis to identify cold-responsive genes in amur carp (cyprinus carpio haematopterus), PLoS One, 10(6): eO 130526 Stadtman E.R., and Levine R.L., 2003, Free radical-mediated ox­idation of free amino acids and amino acid residues in pro­teins, Amino Acids (Vienna), 25(3-4): 207-218 Thomashow M.F., 1999, Plant cold acclimation: freezing toler­ance genes and regulatory mechanisms, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 50: 571-599
Mai W.J., Yan J.L., Wang L., Zheng Y., Xin Y., and Wang W.N., 2010, Acute-acidic exposure induces p
53-mediated oxida­tive stress and dna damage in tilapia (Oreochromis niloticas) blood cells, Aquat. Toxicol., 100(3): 271-281
Near T.J., Domburg A., Kuhn K.L., Eastman J.T., Pennington J.
N., Patamello T., Zane L., Femaandez D.A., and Jones C.D., 2012, Ancient climate change, antifreeze, and the evolution­ary diversification of Antarctic fishes, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 109: 3434-3439
Wilson R.S., Kuchel L.J., Franklin C.E., and Davison W., 2002, Turning up the heat on subzero fish: thermal dependence of sustained swimming in an antarctic notothenioid, J. Therm.
Biol., 27(5): 381-386
Zerai D.B., Fitzsimmons K.M., and Collier R.J., 2010, Transcrip­tional response of delta-9~desaturase gene to acute and chronic cold stress in nile tilapia, Oreochromis niloticus,J.
World Aquacult. Soc., 41(5): 800-806

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。