Vol.41No.2Feb.2021
上海交通大学学报（医学版）JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)
脐静脉内皮细胞外泌体对炎症因子刺激下前软骨细胞凋亡的影响
杨润泽*，许文宁*，郑火亮，蒋盛旦
上海交通大学医学院附属新华医院脊柱中心，上海200092
［摘要］目的·探讨脐静脉内皮细胞外泌体对炎症刺激下小鼠前软骨细胞ATDC5凋亡的影响。方法·采用试剂盒分离人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）外泌体，采用Western blotting检测外泌体标志蛋白肿瘤易感基因101（tumor susceptibility gene101，Tsg101）、白细胞分化抗原9（cluster differentiation9，CD9）、凋亡相关基因2互作蛋白X（apoptosis linked gene-2-interacting protein X，Alix）的表达水平。透射电镜观察外泌体形态，粒度检测鉴定外泌体大小。使用荧光显微镜观察外泌体被小鼠前软骨细胞ATDC5摄取过程和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成情况。TUNEL染和流式细胞术检测外泌体对白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）刺激下的ATDC5细胞凋亡的影响。Western blotting检测外泌体对于ATDC5细胞中凋亡相关蛋白B 淋巴细胞瘤2（B-cell lymphoma/le
ukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associated X protein，Bax）、裂解的半胱天冬酶3（cleaved caspase-3，c-caspase-3）和抗氧化应激相关蛋白核因子E2相关因子2（nuclear factor E2related factor2，Nrf-2）、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein1，Keap-1）、血红素加氧酶1（heme oxygenase1，HO-1）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶1（NADPH quinone oxidoreductase-like protein1，NQO-1）表达水平的影响。结果·透射电镜下观察到HUVEC来源的外泌体呈椭圆形，中空，双层膜，并且阳性表达外泌体标志物CD9、Alix、Tsg101。与IL-1β刺激下的ATDC5细胞相比，外泌体促进炎症因子作用下的ATDC5细胞内ROS的生成（P=0.000）和凋亡的发生（P=0.000），Bax、c-caspase-3、Keap-1表达升高，Bcl-2、Nrf-2、HO-1、NQO-1表达降低。结论·HUVEC来源的外泌体可能通过抑制ATDC5细胞抗氧化应激的能力，促进IL-1β刺激下ATDC5细胞凋亡的发生。
［关键词］外泌体；骨关节炎；前软骨细胞；脐静脉内皮细胞；氧化应激；凋亡
［DOI］10.3969/j.issn.1674-8115.2021.02.004［中图分类号］R684.3［文献标志码］A
Effects of exosomes derived from human umbilical vein endothelial cells on apoptosis of pre-chondrogenic cells stimulated by inflammatory factors
YANG Run-ze*,XU Wen-ning*,ZHENG Huo-liang,JIANG Sheng-dan
Department of Clinic of Spine Center,Xinhua Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai200092,China
[Abstract]Objective·To investigate the effect of exosomes derived from umbilical vein endothelial cells(HUVECs)on apoptosis of murine pre-chondrogenic cell line ATDC5cells under inflammatory stimulation.Methods·The exosomes derived from HUVECs were isolated by using an exosome isolation kit.Western blotting was used to detect the exosome marker proteins,including tumor susceptibility gene101(Tsg101),cluster differentiation9 (CD9)and apoptosis linked gene-2-interacting protein X(Alix).The morphology of exosomes was observed by transmission electron microscope,and the size of exosomes was identified by particle size detection.Fluorescence microscope was used to observe the ATDC5cell uptake of exosomes and the production of reactive oxygen species(ROS).TUNEL staining and flow cytometry were used to examine the effect of exosomes on ATDC5cell apoptosis stimulated by interleukin-1β(IL-1β).Western blotting was used to detect the effect of exosomes on the expression levels of ATDC5apoptosis-related proteins such as B-cell lymphoma/leukemia2(Bcl-2),Bcl-2associated X protein(Bax),cleaved caspase-3(c-caspase-3)and anti-oxidative stress-related proteins such as nuclear factor E2related factor2(Nrf-2),Kelch-like ECH-associated protein1(Keap-1),heme oxygenase1(HO-1)and NADPH quinone oxidoreductase-like protei
n1(NQO-1)under IL-1βstimulation.Results·Under the transmission electron microscope,the HUVEC-derived exosomes were oval,hollow,double-layered,and positively expressed exosome markers CD9,Alix and Tsg101.Compared with the ATDC5cells stimulated by IL-1β,ATDC5cells stimulated by IL-1βincubated with exosomes had higher level of ROS(P=0.000)and higher apoptosis rate(P=0.000).
The expression of Bax,c-caspase-3and Keap-1increased,and the expression of Bcl-2,Nrf-2,HO-1and NQO-1decreased in ATDC5cells exposed to IL-1βand exosomes compared to ATDC5cells only exposed to IL-1β.Conclusion·HUVEC-derived exosomes may promote ATDC5cells apoptosis under the stimulation of IL-1βby inhibiting the ability of ATDC5cell to resist oxidative stress.
[Key words]exosome;osteoarthritis(OA);pre-chondrogenic cell;human umbilical vein endothelial cell(HUVEC);oxidative stress;apoptosis
论著·基础研究
[基金项目]国家自然科学基金面上项目（81672206）；上海市教育委员会高峰高原学科建设计划（20181809）。
[作者简介]杨润泽（1994—），男，硕士生；：******************。许文宁（1991—），男，博士生；：*******************。*为共同第一作者。
[通信作者]蒋盛旦，：***************************。
[Funding Information]National Natural Science Foundation of China(81672206);Shanghai Municipal Education Commission—Gaofeng Clinical Medicine Grant Support (20181809).
[Corresponding Author]JIANG Sheng-dan,E-mail:***************************.
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2021,41（2）上海交通大学学报（医学版）
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是全球较常见的关节疾病。据报道，约10%的男性和13%的女性在60岁以上会发生膝关节OA［1］。由于人口老龄化和肥胖症的增多，OA的发病率也不断增加［2］。OA患者常伴有关节软骨进行性破坏、关节积液、行动能力丧失等［3］。软骨细胞是软骨中唯一的细胞类型，在OA发病过程中会发生多种变化，例如增殖和分泌能力的改变［4］。软骨细胞的异常凋亡、炎症反应等与OA中软骨降解有关［5-6］。因此，探讨软骨细胞功能障碍的机制有助于OA的诊断和。OA 常常伴随有不同程度炎症的发生，在其炎症发展的过程中，白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）发挥着重要的作用，可通过促进炎症介质前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）及一氧化氮（nitric oxide，NO）等的释放激活炎症反应［7］。外泌体作为细胞内吞过程中主动分泌的直径为50~100nm的
reactive oxygen species (ros)囊泡，具有脂质双层膜结构，可以从不同的细胞类型中释放，并已被证明在细胞通信中起到重要作用。外泌体可以在血液及关节滑液中稳定存在［8］。越来越多的证据［9］表明，外泌体参与OA、类风湿关节炎等关节疾病的发展。外泌体分泌或摄取失调可以导致急慢性炎症，继而引起软骨变性和关节破坏［10］。血管内皮细胞在人体内广泛分布，其分泌的外泌体对多种疾病的发生发展有重要作用，例如骨质疏松、糖尿病等［11-12］，但血管内皮细胞分泌的外泌体在OA中的作用未有详细报道。本研究利用IL-1β刺激前软骨细胞建立OA体外模型，探究血管内皮细胞分泌的外泌体对于OA的影响。
1材料与方法
1.1主要试剂
DMEM高糖细胞培养液购自美国Hyclone公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司，IL-1β购自上海达科为生物技术公司，活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒购自上海翊圣生物科技公司，RIPA裂解液、BCA试剂盒、电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）显影试剂、4%多聚甲醛固定液、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、C1090一步法末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TdT mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒、羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗购自上海碧云天生物技术公司，白细胞分化抗原9（cluster differentiation9，CD9；20597-1-AP）、凋亡相关基因2互作蛋白X （apoptosis linked gene-2-interacting protein X，Alix；12422-1-AP）、肿瘤易感基因101（tumor susceptibility gene101，
Tsg101；14497-1-AP）、裂解的半胱天冬酶3（cleaved caspase-3，c-caspase-3；19677-1-AP）、B淋巴细胞瘤2（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2；12789-1-AP）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associated X protein，Bax；50599-2-Ig）、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein1，Keap-1；10503-2-AP）、核因子E2相关因子2（nuclear factor E2related factor2，Nrf-2；16396-1-AP）、β-actin（66009-1-Ig）抗体购自中国Proteintech公司，血红素加氧酶1（heme oxygenase1，HO-1；sc-390991）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶1（NADPH quinone oxidoreductase-like protein1，NQO-1；sc-32793）抗体购自美国Santa Cruz公司，总外泌体分离试剂盒购自美国Invitrogen公司。
1.2细胞培养
人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）、小鼠前软骨细胞株ATDC5购自ATCC公司。细胞培养于完全培养基（DMEM高糖培养液，含10%FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素）中，在37℃、5%CO
2
环境下常规培养，培养2~3d 根据细胞生长情况换液。其中HUVEC常规培养至细胞密度达80%以上时更换为无血清DMEM高糖培养基，继续培养48h后收集细胞培养液。
1.3外泌体的分离与鉴定
1.3.1外泌体分离方法收集2×107个HUVEC的培养液，按照试剂盒说明书分离外泌体。4℃、500×g离心5min后收集上清液，4℃、2000×g离心1h后，丢弃沉淀，吸取上清液后，与一半体积的试剂盒中的外泌体提取液混匀后，4℃过夜。第2日，4℃、10000×g离心1h 后，去除上清液，用1mL无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）重悬沉淀，再次4℃、10000×g离心70min后，弃上清液，用200μL PBS溶解沉淀即可获得外泌体。
1.3.2透射电镜观察外泌体形态取新鲜提取的外泌体悬液10μL，滴加到铜网上，室温过夜干燥后，使用乙酸双氧铀复染。随后透射电镜（美国Delong公司）上机成像观察并拍照保存。
1.3.3纳米颗粒跟踪分析取100μL外泌体悬液，用1×PBS稀释10倍后，置于比皿中后放入粒度仪（新西兰Izon Science公司）中检测外泌体粒径分布。
1.3.4Western blotting检测外泌体标志物向200μL外泌体悬液中加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上
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杨润泽，等脐静脉内皮细胞外泌体对炎症因子刺激下前软骨细胞凋亡的影响
裂解30min后，4℃、12000×g离心10min，取上清液。BCA法测定蛋白浓度后。取适量5×十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液，100℃煮10min后，冷却到室温。按照每孔20μg蛋白样品上样，设置80V电压电泳约30min，调整电压到120V，待溴酚蓝进入到凝胶底部终止电泳。选用PVDF膜，湿转70min，使用5%脱脂牛奶室温封闭1h，一抗CD9（1∶1000）、Alix（1∶1000）、Tsg101（1∶1000）4℃孵育过夜。二抗（1∶2000）室温孵育1h，ECL反应后，曝光显影并保存图像。
1.4外泌体摄取实验
使用稀释后的PKH26荧光染料（美国Sigma公司），在避光条件下对20μL外泌体的磷脂双分子膜染5min 后，加入等体积10%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）终止染后重悬外泌体沉淀。将染后的外泌体加入到ATDC5培养液中分别培养3h和6h。待共培养结束后，去除细胞培养上清液后，PBS清洗；加入4%多聚甲醛避光固定后，DAPI染细胞核，再次PBS 清洗；加入抗荧光淬灭剂，荧光显微镜（德国Leica公司）观察拍照。
1.5细胞分组及处理方法
将ATDC5细胞分为空白对照（NC）组、IL-1β组、IL-1β+50μg外泌体组、IL-1β+100μg外泌体组。除了NC组外，每组均加入10ng/mL IL-1β，模拟OA体外模型；其中IL-1β+50μg外泌体组和IL-1β+100μg外泌
体组，再分别加入50μg及100μg外泌体，作用24h。
1.6细胞内ROS水平检测
将ATDC5细胞培养于6孔板上，待细胞密度为60%~ 70%时，分别加入500μL PBS、10ng/mL IL-1β、10ng/ mL IL-1β+50μg外泌体、10ng/mL IL-1β+100μg外泌体，作用24h后，弃细胞培养液，PBS洗涤，加入2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorofluorescein-diacetate，DCFH-DA）荧光探针避光染30min，PBS洗涤后荧光显微镜检测橙荧光。
1.7细胞凋亡检测
1.7.1TUNEL检测ATDC5细胞凋亡使用一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。ATDC5细胞按上述细胞处理方法处理完毕后，去除培养液，PBS洗涤1次，4%多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗涤1次后加
入免疫染强力通透液室温孵育5min。PBS洗涤2次，再加入配置好的TUNEL检测液37℃避光孵育60min，孵育结束后PBS洗涤3次，并使用DAPI复染细胞核，荧光显微镜观察结果。
1.7.2流式细胞术检测ATDC5细胞凋亡ATDC5细胞按密度为6×105个/mL接种于6孔板，除空白对照（不进行任何处理）和Annexin V-FITC或碘化丙啶（propidium iodide，PI）单染外，细胞分为3组：正常对
照组（Annexin V-FITC和PI双染）、10ng/mL IL-1β组、10ng/mL IL-1β+ 100μg外泌体组。孵育24h后，PBS洗涤2次，0.25%胰酶消化，终止消化后，300×g离心5min，收集细胞；用预冷的PBS重悬后再次离心弃上清液，加入200μL结合缓冲液悬浮细胞，加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI混匀，室温避光孵育15min后，流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）检测细胞早期和晚期凋亡情况。
1.8Western blotting测定细胞中凋亡蛋白和抗氧化应激
相关蛋白表达
按上述细胞处理方法分组干预24h后收集细胞，PBS 洗涤2次，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解30min后，用细胞刮刀刮下裂解后的细胞，离心，提取细胞总蛋白，取10μL蛋白样品，利用BCA法测蛋白浓度后，蛋白样品（20μg总蛋白）于12%SDS-PAGE 凝胶上分离蛋白组分。一抗HO-1（1∶1000）、NQO-1（1∶1000）、Nrf-2（1∶1000）、Keap-1（1∶1000）、c-caspase-3（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000）、Bax（1∶1000），4℃孵育过夜，次日TBST缓冲液漂洗后二抗（1∶2000）室温孵育1h，ECL反应曝光显影后保存结果进行分析。
1.9统计学分析
采用SPSS20.0软件对数据进行处理。定量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用独立样本t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。
2结果
2.1HUVEC来源外泌体的结构特征
透射电镜下可以观察到HUVEC分泌的外泌体呈现脂质双层膜包绕形成的典型茶托状形态特征（图1A）。利用Western blotting可检测到其蛋白标志物CD9、Alix和Tsg101的表达（图1B）。粒度分析检测表明，HUVEC来源的外泌体粒径主要分布在100~200nm（图1C）。
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上海交通大学学报（医学版）2.2ATDC5细胞对HUVEC 来源外泌体的摄取
荧光显微镜观察结果显示，被PKH26荧光染料标记的
外泌体与ATDC5细胞共培养6h 后，外泌体可被ATDC5细胞成功摄取至细胞质中，并在细胞核周围聚集（图2）。
2.3HUVEC 来源外泌体对于IL-1β刺激下的ATDC5细胞ROS 生成的影响
与NC 组相比，10ng/mL IL-1β作用ATDC5细胞24h
后，细胞内的ROS 橙荧光增强；同时加入50μg 外泌体和10ng/mL IL-1β刺激24h 后，与单纯IL-1β刺激相比，ATDC5细胞内ROS 橙荧光强度进一步增加（图3）
。
Note ：A.HUVEC-derived exosomes were observed by transmission electron microscopy.B.The expression of the exosome markers TSG101,CD9and Alix was confirmed
by Western blotting.C.The size distribution of HUVEC-derived exosomes.图1HUVEC 来源外泌体的鉴定
Fig 1Identification of HUVEC-derived
exosomes
图2荧光染料PKH26标记的外泌体与ATDC5细胞共培养3h 和6h 后的摄取情况
Fig 2Uptaking of PKH26-labeled exosomes co-cultured with ATDC5cells for 3h and 6
h
Note ：A.Detection of ROS production by DCFH-DA assay.B.Quantitative analysis of the fluorescence intensity of ATDC5cells under different —
exosomes.①P =0.000.
图3ATDC5细胞内ROS 检测
Fig 3Detection of ROS in ATDC5cells
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杨润泽，等脐静脉内皮细胞外泌体对炎症因子刺激下前软骨细胞凋亡的影响
2.4HUVEC 来源外泌体对于IL-1β刺激下ATDC5细胞凋亡的影响
利用TUNEL 染和流式细胞术检测ATDC5细胞凋
亡，TUNEL 染结果显示：与NC 组相比，10ng/mL IL-1β刺激24h 组细胞凋亡率升高，同时加入50μg 外泌体
后，ATDC5细胞凋亡率进一步升高（图4A 、B ）。流式细胞术检测结果也显示：与NC 组相比，10ng/mL IL-1β刺激24h 组ATDC5细胞总凋亡率升高，同时加入50μg 外泌体后，ATDC5细胞总凋亡率进一步升高（图5A 、B ）
2.5HUVEC 来源外泌体对IL-1β刺激下ATDC5细胞凋亡和抗氧化应激相关蛋白表达的影响
Western blotting 检测结果显示，炎症因子IL-1β处理
ATDC5细胞24h 的IL-1β组，凋亡相关蛋白Bax 、c-caspase-3表达量较NC 组明显上升，Bcl-2表达量较NC
组下降；而与IL-1β组相比，IL-1β+50μg 外泌体组和IL-1β+100μg 外泌体组的Bax 、c-caspase-3表达量进一步上升，Bcl-2的表达量逐渐下降（图6A ）。按上述分组，抗氧化应激相关蛋白Nrf-2、HO-1、NQO-1的表达量逐渐下降，Keap-1表达量逐渐升高（图6B ）
。
Note ：A.TUNEL staining of ATDC5cells.B.Comparison of cell apoptosis rate among NC group,IL-1βgroup and IL-1β+ —exosomes.①P =0.000.图4TUNEL 法检测ATDC5细胞凋亡
Fig 4Detection of apoptosis of ATDC5cells by TUNEL
assay
Note ：A.Analysis of cell apoptosis by Annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry analysis.B.Quantitative analysis of total cell apoptosis rate in NC group,IL-1βgroup and IL-1β+ —exosomes.①P =0.000.图5流式细胞术检测ATDC5细胞凋亡
Fig 5Detection of apoptosis of ATDC5cells by flow cytometry
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