㊃论  著㊃
[收稿日期]2016-02-06;[修回日期]2016-03-03
[基金项目]河北省科技计划项目(13277717D )
[作者简介]王素玲(1976-)，女，河北玉田人，河北省血液中心主管检验师，医学博士，从事血液保存方法的改进相关研究㊂
*通讯作者㊂E -m a i l :w a n g q
i e 1012@163.c o m 去白悬浮红细胞储存过程中A T P ㊁2,3-D P G
含量变化与氧化应激的相关性分析
王素玲1，韩 卫1，何路军1，王艳彬1，王 切2*
(1.河北省血液中心检验科，河北石家庄050071;2.河北医科大学基础医学院人体解剖学教研室，河北石家庄050017)  [摘要] 目的探讨去白悬浮红细胞储存过程中三磷酸腺苷(a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e ,A T P )㊁2,3-二磷酸甘油酸(2,3-d i p h o s p h o g l y c e r a t e ,2,3-D P G )含量变化与氧化应激的相
关性㊂方法采集志愿者血液，制备去白悬浮红细胞，于2~6ħ保存㊂于保存7d ㊁14d ㊁28d ㊁42d 时，应用荧光酶标仪测定去白悬浮红细胞内活性氧族(r e a c t i v e
o x y g e n s p e c i e s ,R O S )含量，采用分光光度法测定细胞外过氧化氢(h y d r o g e n p e r o x i d e ,H 2O 2)含量，采用化学比法测定A T P 含量，采用紫外测试法测定2,3-D P G 含量㊂对去白悬浮红细胞内R O S ㊁A T P ㊁2,3-D P G 和细胞外H 2O 2含量与储存时间进行相关性分析；对去白悬浮红细胞内A T P ㊁2,3-D P G 含量与R O S ㊁H 2O 2含量进行相关性分析㊂结果随着储存时间的延长，去白悬浮红细胞内R O S 含量和细胞外H 2O 2含量均明显升高，保存42d 的R O S 和H 2O 2含量明显高于保存7d ㊁14d 和28d 红细胞的R O S 和H 2O 2含量，且R O S 和H 2O 2含量与储存时间均呈正相关㊂去白悬浮红细胞内A T P ㊁2,3-D P G 含量却明显降低，保存42d 的A T P ㊁2,3-D P G 含量明显低于保存7d ㊁14d 和28d 红细胞的A T P ㊁2,3-D P G 含量，并且A T P ㊁2,3-D P G 含量与储存时间均呈负相关㊂去白悬浮红细胞内A T P ㊁2,3-D P G 含量与R O S ㊁H 2O 2含量也呈负相关㊂结论随储存时间延长，去白悬浮红细胞内A T P 和2,3-D P G 含量逐渐降低,
与红细胞内氧化应激反应逐渐增强密切相关㊂  [关键词] 血液保存；腺苷三磷酸;2,3-二磷酸甘油酸  d o i :10.3969/j
.i s s n .1007-3205.2017.02.017  [中图分类号] R 31.122;R 954  [文献标志码] A  [文章编号] 1007-3205(2017)02-0192-04
C o r r e l a t i o na n a l y s i s b e t w e e nA T P ,2,3-
D P Gc o n c e n t r a t i o n i n s u s p
e n d e d r e d b l o o d c e l l sw i t h o u t l e u k o c y t e a n dO x i d a t i v e s t r e s s d u r i n g s t o r a g
e WA N GS u -l i n g 1,H A N W e i 1,H EL u -j
u n 1,WA N G Y a n -b i n 1,WA N G Q i e 2*
(1.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y ,H e b e iB l o o dC e n t e r ,S h i j i a z h u a n g 0
50071,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f H u m a nA n a t o m y ,t h eS c h o o l o f B
a s i cM e d i c a lS c i e n c e s ,H e
b e i M e d i
c a lU n i v e r s i t y ,S h i j i a z h u a n g 0
50017,C h i n a )[A b s t r a c t ]O b j
e c t i v e  T oi n v e s t i g a t et h ec o r r e l a t i o n b e t w e e n t h ec h a n g e o fa d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e (A T P ),2,3-d i p h o s p h o g l y c e r a t e (2,3-D P G )c o n c e n t r a t i o na n do x i d a t i v es t r e s s l e v e l i n s u s p e n d e d r e db l o o d c e l l sw i t h o u t l e u k o c y t e d u r i n g s t o r a g
e .M e t h o d s  T h e b l o o do
f v o l u n t e e r s w e r e c o l l e c t e d t o p r e p a r e s u s p e n d e dr e db l o o dc e l l sw i t h o u t l e u k o c y t e .T h e s u s p
e n d e dr e db l o o d c e l l sw e r e s t o r e d a t 2-6ħ.O n d a y 7,d a y 14,d a y 28a n d d a y 42o
f s t o r a
g e ,t
h e c o n c e n t r a t
i o n o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s (R O S )i n r e db l o o dc e l l sw a sd e t e c t e db y f l u o r e s c e n c em i c r o p
l a t e r e a d e r ,t h e c o n c e n t r a t i o no f h y d r o g e n p e r o x i d e (H 2O 2)o u t s i d e c e l lw a s d e t e c t e dw i t h s p e c t r o p h o t o m e t r i c m e t h o d ,t h e c o n c e n t r a t i o n o fA T Pw a s d e t e c t e dw i t h c h e m i c a l c h r o m a t o m e t r y
,t h e 2,3-D P Gw a s d e t e c t e dw i t hU v t e s tm e t h o d .C o r r e l a t i o n a n a l y s i s b e t w e e n t h eR O S ,H 2O 2,
A T P ,2,3-D P Ga n d s t o r a g e t i m e w e r ec a r r i e do u t ,r e s p e c t i v e l y .C o r r e l a t i o na n a l y
s i sb e t w e e n A T P ,2,3-D P G a n d ㊃
291㊃第38卷第2期2017年2月
河
北
医
科
大
学
学
报
J O U R N A L O F H E B E I M E D I C A L U N I V E R S I T Y
V o l .38 N o .2
F e b . 2017  Copyright ©博看网. All Rights Reserved.
R O S,H2O2w e r ec a r r i e do u t,r e s p e c t i v e l y.R e s u l t s W i t ht h ee x t e n s i o no fs t o r a g et i m e,t h e c o n c e n t r a t i o no fR O Sa n dH2O2w e r e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d,t h eR O Sa n d H2O2c o n t e n t o nd a y 42o f s t o r a g ew e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t
h a t o f d a y7,d a y14a n d d a y28.T h e r ew e r e p o s i t i v e c o r r e l a t i o nb e t w e e n R O S a n d s t o r a g et i m e,b e t w e e n H2O2a n d s t o r a g et i m e.B u t w i t ht h e e x t e n s i o no f s t o r a g e t i m e,t h e c o n c e n t r a t i o no fA T Pa n d2,3-D P G w e r es i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d. T h eA T Pa n d2,3-D P Gc o n t e n t o nd a y42o f s t o r a g ew e r e s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h a t o f d a y7, d a y14a n d d a y28.T h e r ew e r e n e g a t i v e c o r r e l a t i o nb e t w e e nA T Pa n d s t o r a g e t i m e,b e t w e e n2,3-D P Ga n d s t o r a g e t i m e.T h e r ew e r en e g a t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e n A T Pa n dR O S,b e t w e e n A T P a n dH2O2,b e t w e e n2,3-D P G a n d R O S,b e t w e e n2,3-D P G a n d H2O2.C o n c l u s i o n W i t ht h e e x t e n s i o no f s t o r a g e t i m e,t h ec o n c e n t r a t i o no fA T Pa n d2,3-D P Gi ns u s p e n d e dr e db l o o dc e l l s w i t h o u tl e u k o c y t e w e r e g r a d u a l l y r e d u c e d,w h i c hi s c l o s e l y r e l a t e d w i t h t h ei n c r e a s i n g o f o x i d a t i v e s t r e s s r e a c t i o n.
[K e y w o r d s]b l o o d p r e s e r v a t i o n;a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e;2,3-d i p h o s p h o g l y c e r a t e
红细胞输注是临床上提高血液运氧能力，改善组织缺氧状态的一种重要手段㊂但随储存时间的延长，红细胞会发生 储存损伤 [1]，明显的改变为三磷酸腺苷(a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e,A T P)㊁2,3-二磷酸甘油酸(2,3-d i p h o s p h o g l y c e r a t e,2,3-D P G)减少㊂这不仅降低了红细胞的运氧能
力，还可能引起严重的输血后并发症，增加患者病死率[2-5]㊂研究表明氧化应激所产生的大量活性氧族(r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s,R O S)是导致红细胞储存损伤的重要机制之一[6-7]㊂悬浮红细胞是目前国内外临床上应用最为广泛的血液制剂，在悬浮红细胞储存过程中,A T P㊁2,3-D P G的含量变化与细胞内外氧化应激水平的相关性，尚未见报道㊂本研究将去白悬浮红细胞于2~6ħ储存，分别于储存第7㊁14㊁28㊁42d 观察去白悬浮红细胞内R O S㊁A T P㊁2,3-D P G和细胞外过氧化氢(h y d r o g e n p e r o x i d e,H2O2)含量变化，并进行A T P㊁2,3-D P G含量与R O S,H2O2含量的相关性分析，报告如下㊂
1材料与方法
1.1去白悬浮红细胞的制备及处理全血采自6例健康献血者，每例采血400m L㊂将采集到的血液标本按照国家‘全血及成分血质量要求“[8]的规定进行乙型肝炎病毒㊁丙型肝炎病毒㊁人类免疫缺陷病毒㊁梅毒螺旋体等经输血传播病原体检测㊂检验合格后的血液严格按照‘血站技术操作规程(2012版)“[9]操作步骤制备成去白悬浮红细胞㊂采用无菌接合机将去白悬浮红细胞分装到4个空血袋内，分为7d组㊁14d组㊁28d组和42d组，然后将各组血液均置于2~6ħ保存㊂分别于贮存的7d㊁14d㊁28 d㊁42d观察各组去白悬浮红细胞内R O S㊁A T P㊁2,3-D P G含量及细胞外H2O2含量变化㊂
1.2主要试剂 R O S检测试剂盒为碧云天生物技术研究所产品,H2O2测定试剂盒㊁A T P测定试剂盒㊁血红蛋白测定试剂盒均为南京建成科技有限公司产品,2,3-D P G测定试剂盒为德国R o c h e公司产品㊂
1.3去白悬浮红细胞内R O S含量测定取200μL 悬浮红细胞,2000r/m i n离心5m i n，弃上清㊂加入2倍体积生理盐水，轻轻洗涤红细胞,2000r/m i n 离心5m i n，弃上清㊂按上述步骤将红细胞洗涤3次㊂向红细胞沉淀内加入200μL生理盐水悬浮细胞，吸取50μL细胞悬液并加入450μL生理盐水，将细胞稀释10倍㊂吸取100μL稀释的细胞悬液, 2000r/m i n离心5m i n，弃上清，加入稀释好的D C F H-D A(1ʒ1000生理盐水稀释)200μL㊂于37ħ细胞培养箱内孵育30m i n，每隔5m i n颠倒混匀1次㊂2000r/m i n离心5m i n，弃上清，终止反应㊂用200μL生理盐水将红细胞洗涤3次㊂加入等体积R I P A细胞裂解液将细胞裂解㊂将细胞裂解产物加入到黑96孔检测板内，通过荧光酶标仪测定荧光值(激发波长488n m，发射波长525n m)㊂吸取20μL细胞裂解产物按试剂盒操作说明测定其血红蛋白含量㊂通过荧光值与血红蛋白值之比表示红细胞内R O S含量㊂
1.4去白悬浮红细胞内A T P含量测定检测步骤按试剂盒操作说明进行㊂
1.5去白悬浮红细胞内2,3-D P G含量测定取1 m L悬浮红细胞于2500r/m i n4ħ离心10m i n，弃上清㊂向红细胞沉淀内加入5m L冰的高氯酸(0.6 m o l/L)立即混匀㊂5000r/m i n4ħ离心10m i n 后，吸取4m L无上清㊂在上清内加入0.5m L
2.5
㊃391㊃
河北医科大学学报第38卷第2期Copyright©博看网. All Rights Reserved.
m o l/L碳酸钾，冰浴2h㊂5000r/m i n4ħ离心10 m i n后去除高氯酸盐沉淀，取0.1m L上清用于检测㊂检测步骤按试剂盒操作说明进行㊂
1.6去白悬浮红细胞外H2O2含量测定收集1 m L储存的去白悬浮红细胞,3000r/m i n4ħ离心10m i n，收集上清，用于H2O2含量测定㊂检测步骤按试剂盒操作说明进行㊂
1.7统计学方法应用S P S S13.0统计学软件处理数据㊂计量资料比较分别采用单因素方差分析和S N K-q检验；相关性采用P e a r s o n相关分析㊂P< 0.05为差异有统计学意义㊂
2结果
2.1去白悬浮红细胞内R O S㊁A T P㊁2,3-D P G和细胞外H2O2含量变化随着红细胞保存时间的延长,R O S和H2O2含量呈逐渐升高趋势，保存14d㊁28d的红细胞内R O S含量高于保存7d，保存42d 的红细胞内R O S含量又高于保存7d㊁14d和28d (P<0.05)；保存28d和42d的红细胞外H2O2含量高于保存7d和14d，保存42d的红细胞外H2O2含量高于保存28d(P<0.05)；随着保存时间的延长，红细胞内A T P和2,3D P G含量呈逐渐下降趋势，保存14d㊁28d㊁42d的红细胞内A T P和2,3-D P G含量低于保存7d，保存42d的红细胞内A T P含量低于保存14d和28d(P<0.05)；保存28d和42d的红细胞内2,3-D P G含量低于保存14 d，保存42d的红细胞内2,3-D P G含量少于保存28 d(P<0.05)㊂见表1㊂
表1不同保存时间R O S㊁H2O2㊁A T P和2,3-D P G比较
T a b l e1T h e c o m p a r i s o no fR O S,H2O2,A T Pa n d2,3-D P Gi nd i f f e r e n t s t o r a g e t i m e
(n=6,x-ʃs)检测时间R O S H2O2(mm o l/L)A T P(μm o l/g H b)2,3-D P G(μg/L)
7d204.26ʃ28.6958.76ʃ2.053.81ʃ0.40517.06ʃ106.24
14d245.17ʃ15.81*69.75ʃ5.863.14ʃ0.45*417.64ʃ62.91*
28d274.98ʃ27.2*102.05ʃ19.55*#2.66ʃ0.57*311.88ʃ40.49*#
42d313.55ʃ28.36*#ә155.67ʃ13.06*#ә1.95ʃ0.20*#ә171.35ʃ38.14*#ә
F19.617105.70320.29628.693
P0.0000.0000.0000.000
*P<0.05与7d比较P<0.05与14d比较 әP<0.05与28d比较(S N K-q检验)
2.2相关性分析去白悬浮红细胞内R O S及细胞
外H2O2含量与储存时间呈正相关(P<0.01)；去
白悬浮红细胞内A T P㊁2,3-D P G含量与储存时间呈
负相关(P<0.01);A T P㊁2,3-D P G含量与R O S和
H2O2含量呈负相关(P<0.01)㊂见表2,3㊂
表2去白悬浮红细胞储存中R O S㊁H2O2㊁A T P㊁
2,3-D P G与储存时间的相关性分析
T a b l e2T h e c o r r e l a t i o nb e t w e e nR O S,H2O2,
A T P,2,3-D P Ga n d s t o r a g e t i m e
变量
储存时间
r P
R O S0.8490.000
H2O20.9690.000
A T P-0.8560.000
2,3-D P G-0.8970.000
表3去白悬浮红细胞储存中A T P㊁2,3-D P G与R O S㊁
H2O2的相关性分析
T a b l e3T h e c o r r e l a t i o nb e t w e e nA T P,2,3-D P Ga n dR O S, H2O2d u r i n g s t o r a g e o f s u s p e n d e d r e db l o o d
c e l l sw i t h o u t l e u k o c y t e
变量A T P
r P
2,3-D P G r P
R O S-0.6450.001-0.8230.000 H2O2-0.7850.000-0.8540.0003讨论
去白悬浮红细胞是目前国内外临床应用最为广
泛的血液制剂，适用于大多数需要补充红细胞㊁提高
血液携氧能力的患者，也是改善急性大出血㊁严重创
伤㊁器官移植等大量失血患者机体缺氧状态的一种
主要手段㊂但随储存时间的延长，红细胞会发
生储存损伤㊂实验研究和临床调查均表明，储存损
伤红细胞的运氧能力已降低，输注长时间保存的红
细胞还可能增加肾衰竭㊁败血症㊁感染㊁多器官功能
衰竭等并发症发生率，甚至增加患者的病死
率[10-14]㊂因此，去白悬浮红细胞储存过程中的损伤变化已引起高度重视㊂
红细胞富含氧气和血红蛋白㊂在储存过程中,
血红蛋白会不断发生自动氧化，在这个过程中会有
大量R O S产生，如O2-㊁O H和H2O2等,R O S与红细胞膜内的脂质㊁重要活性蛋白㊁结构蛋白发生过氧化反应，改变膜的结构和功能，引起细胞损伤甚至死亡[15]㊂这是引起红细胞储存损伤的重要机制之一㊂本研究结果显示，随着储存时间的延长，去白悬浮红细胞内R O S含量和细胞外H2O2含量都逐渐
㊃491㊃河北医科大学学报第38卷第2期
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增加；在去白悬浮红细胞储存过程中，红细胞内R O S含量与储存时间㊁细胞外H2O2含量与储存时间均呈正相关㊂表明随着去白悬浮红细胞储存时间延长，细胞内外的R O S含量都逐渐增加，即去白悬浮红细胞内外的氧化应激反应随储存时间延长而增强㊂
A T P是红细胞内的能量物质，其浓度的高低是判断红细胞活性的重要指标之一，对维持红细胞的正常代谢㊁结构和功能至关重要㊂2,3-D P G常被作为红细胞携氧能力的标志物㊂当其与血红蛋白结合时，即降低了血红蛋白与氧的亲和力，从而促进氧合血红蛋白释放氧㊂因此,A T P和2,3-D P G的含量高低是判断储存红细胞保存质量的重要指标[6]㊂本研究结果显示，随着储存时间的延长，去白悬浮红细胞内的A T
P和2,3-D P G含量明显逐渐降低；在去白悬浮红细胞储存过程中，去白悬浮红细胞内A T P 和2,3-D P G含量与储存时间均呈负相关㊂表明随着储存时间的延长，去白悬浮红细胞内的能量物质减少，携氧能力降低，即随去白悬浮红细胞随储存时间的延长逐渐发生了储存损伤㊂
随着储存时间的延长，去白悬浮红细胞内外的R O S含量均逐渐增加，而标志红细胞保存质量的A T P和2,3-D P G含量却逐渐降低，两者之间是否具有相关性?本研究结果显示，在去白悬浮红细胞储存过程中，红细胞内的A T P和2,3-D P G含量与细胞内R O S㊁细胞外H2O2含量均呈负相关㊂表明去白悬浮红细胞内的A T P和2,3-D P G含量的降低与细胞内外氧化应激反应增强密切相关；随着储存时间的延长，氧化应激可能是导致去白悬浮红细胞储存损伤的主要原因之一㊂
总之，在悬浮红细胞储存过程中，随着储存时间的延长，去白悬浮红细胞内A T P和2,3-D P G含量的逐渐降低与细胞内外氧化应激反应增强密切相关㊂这将为降低红细胞 储存损伤 ㊁改善红细胞储存质量提供一定的理论依据㊂
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(本文编辑：许卓文)
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王素玲等去白悬浮红细胞储存过程中A T P㊁2,3-D P G含量变化与氧化应激的相关性分析Copyright©博看网. All Rights Reserved.

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