肝细胞癌（HCC ）是人类最常见的恶性肿瘤之一，
每年造成约60万人死亡［1,2］。虽然肝移植、手术切除和局部在HCC 早期有效，但由于低反应率和治
疗耐药性［3,4］，对于HCC 患者仍有限［5］
，因此，筛选出新型高效，毒副作用小的药物意义重大。
类黄酮化合物是一种具有抗氧化、抗炎等特性的生
reactive oxygen species (ros)Eriocitrin suppresses proliferation and migration of hepatocellular carcinoma SMMC-7721cells by promoting ROS production and activating the MAPK pathway
ZHOU Hui 1,ZHANG Yuqing 1,GAN Chao 1,FAN Xirui 1,2,QI Zhilin 1,2,QI Shimei 1,2
1
Key Laboratory of Biologically Active Biomacromolecules,2Department of Biochemistry and Molecular Biology,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China
摘要：目的探讨圣草次苷通过ROS/MAPKs 信号轴调控肝癌SMMC-7721细胞增殖和迁移的作用机制。方法分别用0、25、
50、100、150、200、250、300μg/mL 圣草次苷处理肝癌SMMC-7721细胞系24h 后，CCK-8法检测细胞活性；不同浓度的圣草次苷（100、200、300μg/mL ）处理细胞后，运用划痕实验分别在24、48、72h 检测划痕愈合率，Transwell 实验检测细胞迁移率，克隆形成实验检测细胞增殖能力，DAPI 染观察细胞核形态变化，Western blot 检测侵袭蛋白E-cadherin 、N-cadherin 、MMP-2、MMP-9、凋亡因子PARP 和Pro-caspase 3以及MAPKs 通路p-JNK 、p-P38、p-ERK 信号分子；用（分别为2、5、10μmol/L ）ERK 抑制剂U0126、JNK 抑制剂SB203580和P38抑制剂SP600125预先处理细胞2h ，再用200μg/mL 圣草次苷处理细胞24h ，Western blot 检测凋亡蛋白PARP 的切割情况；分别用N-乙酰-半胱氨酸（NAC ）（30μmol/L ）或圣草次苷（100、200、300μg/mL ）单独或共处理细胞后，通过DCFH-DA 荧光探针法分别在15、30、60min 检测内源性活性氧（ROS ）水平。结果圣草次苷在50μg/mL 范围内，对细胞活力基本无影响（P >0.05）；圣草次苷能够显著抑制SMMC-7721细胞的划痕愈合（P <0.0
1），细胞迁移（P <0.01）和克隆形成（P <0.01），在300μg/mL 浓度时作用最显著；圣草次苷明显减少侵袭蛋白N-cadherin 、MMP-2、MMP-9的蛋白表达量（P <0.01），上调E-cadherin 的蛋白表达量（P <0.05）；圣草次苷诱导SMMC-7721细胞发生显著的凋亡形态学变化，Pro-caspase 3表达降低，PARP 切割增多（P <0.01）；圣草次苷在300μg/mL 刺激30min 时ROS 表达水平较高，NAC （30μmol/L ）处理后，细胞内ROS 表达水平下降明显；圣草次苷能够显著诱导MAPKs 信号途径JNK 、P38和ERK 的磷酸化（P <0.01），U0126和SB203580能够增强圣草次苷诱导的PAPR 切割，而SP600125逆转圣草次苷诱导的PARP 切割。结论圣草次苷通过促进细胞内ROS 的合成，诱导MAPKs 信号通路的活化，调控肝癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移和凋亡。关键词：圣草次苷；SMMC-7721；ROS ；MAPKs
Abstract:Objective To investigate the role of the ROS/MAPK signaling axis in mediating the inhibitory effect of eriocitrin on proliferation and migration of hepatocellular carcinoma SMMC-7721cells.Methods SMMC-7721cells were treated with different concentrations of eriocitrin for 24h,and the changes in cell viability were detected with CCK-8assay.The migration and invasion abilities of the treated cells were evaluated using Transwell and scratch healing assays,the cell proliferation was assessed with colony-forming assay,and changes in nuclear morphology were observed with DAPI staining.Western blotting was performed to examine the changes in the expressions of E-cadherin,N-cadherin,MMP-2,MMP-9,P
ARP ,Pro-caspase 3,p-JNK,p-P38,and p-ERK.The effect of eriocitrin on PARP cleavage in SMMC-7721cells pretreated with ERK,JNK and P38inhibitors (U0126,SB203580and SP600125,respectively)was detected using Western blotting.The effect of treatment with N-acetyl-cysteine (NAC,30μmol/L)and eriocitrin (100,200,and 300μg/mL),alone or in combination,on reactive oxygen species (ROS)levels in the cells was examined using a DCFH-DA fluorescent probe.Results Eriocitrin below 50μg/mL did not produce significant effect on the viability of SMMC-7721cells (P >0.05).Treatment with eriocitrin significantly inhibited scratch healing,migration,and colony formation of the cells (P <0.01),reduced the protein expressions of N-cadherin,MMP-2,and MMP-9(P <0.01),and up-regulated E-cadherin protein expression (P <0.05).Eriocitrin-treated SMMC-7721cells showed obvious apoptotic morphologies with decreased Pro-caspase 3expression and increased PARP cleavage (P <0.01)and phosphorylation levels of JNK,P38,and ERK (P <0.01);Eriocitrin-induced PAPR cleavage was obviously enhanced by U0126and SB203580but attenuated by SP600125.Treatment with 300μg/mL eriocitrin for 30min significantly increased ROS level in the cells,and this effect was obviously suppressed by NAC.Conclusion Eriocitrin can suppress the proliferation and migration and promote apoptosis of hepatocellular carcinoma SMMC-7721cells by promoting ROS production and activating the MAPKs signaling pathway.
Keywords:eriocitrin;SMMC-7721;reactive oxygen species;MAPKs 收稿日期：2022-09-29
基金项目：安徽省大学生创新创业训练计划（S202110368008，201910368011，201910368022）；安徽高校自然科学研究项目重大项目（KJ2019ZD31，KJ2020ZD54）；皖南医学院重点科研项目培育基金（WK2018Z09）；活性生物大分子研究安徽省重点实验室项目（1306C083008）作者简介：周慧，本科，E-mail:****************
通信作者：齐世美，教授，博士，硕士生导师，E-mail:***************
doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.03.11J South Med Univ,2023,43(3):412-419
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物活性物质，是具有C6-C3-C6结构的多酚类物质的一个亚类，MAPKs通路（包括p38、JNK和ERK）是类黄酮化合物一个作用靶点［6］。例如非瑟酮作为一种在烟树中发现的天然类黄酮，可通过PKC/ROS/MAPKs通路抑制基质金属蛋白酶-9的激活，调节TPA诱导的乳腺癌细胞侵袭；类黄酮化合物黄芩素可增强热疗诱导的U937细胞凋亡，并通过ROS的生成调节MAPKs通路［7,8］。
圣草次苷（Eriocitrin）是一种常见的类黄酮化合物，在柠檬、酸橙等柑橘类水果中含量丰富，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用［9］。研究表明，圣草次苷可通过调节双特异性磷酸酶14（DUSP14）介
导的Nrf2和核因子-κB （NF-κB）通路，减轻急性肾损伤大鼠缺血再灌注诱导的氧化应激和炎症反应［10］。同时也有研究证明，圣草次苷通过调控JAK2/STAT3和JNK/p38信号通路抑制乳腺癌细胞MCF7的增殖，并且诱导MCF7细胞凋亡［11］。而圣草次苷对于肝癌细胞SMMC-7721的作用还未见相关报道。
癌细胞的增殖、转移能力是癌症恶性程度的关键指标［12］，因此，细胞凋亡被认为是癌症的有效靶点，在细胞凋亡的过程中，线粒体损伤是主要原因，线粒体介导的如Caspase激活途径可触发细胞凋亡［13,14］。此外，线粒体是内源性活性氧（ROS）的主要来源，也是ROS 的靶点［15］，高水平ROS诱导的氧化应激可通过细胞凋亡导致细胞死亡［16,17］。同时，在癌细胞增殖迁移中，ROS 也被认为可通过触发MAPKs通路的激活产生影响［18］。研究发现，一些抗肿瘤药物通过诱导肿瘤细胞内ROS 的产生，激活MAPKs通路从而导致细胞凋亡并抑制肿瘤转移［19-21］，肝癌细胞SMMC-7721是耐药型肝癌细胞株，相对于其它肝癌细胞具有更高的转移和侵袭潜能［22］。综上所述，本研究拟用圣草次苷作用于肝癌细胞SMMC-7721和肝正常细胞L02，探究圣草次苷作用于肝癌细胞SMMC-7721的IC50值，以及相同剂量范围内对肝正常细胞的毒性作用，以此为依据确定圣草次苷发挥抗肿瘤作用的最佳浓度范围。在此基础上进一步探究圣草次苷调控SMMC-7721细胞的增殖迁移、凋亡的可能的内在机制。在分子机制方面将从ROS/MAPKs 信号轴调控角度探讨其作用原理，为圣草次苷用于癌症等相关疾病的预防提供理论支持和科学依据。
1材料和方法
1.1细胞株和细胞培养
本研究中使用的人肝癌SMMC-7721细胞株是从中国科学院典型培养物委员会细胞库购买的。SMMC-7721细胞在含有10%FBS和1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液中，放置于37℃含5%CO2培养箱中培养，并取对数生长期细胞用于实验。
1.2主要器械
细胞培养箱（Thermo）、-80℃冰箱（Thermo Fisher Scientific）、蛋白质电泳、转膜系统（BioRad）、移液器（Eppendorf）、DNM-9602酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司）、荧光倒置显微镜（OLYMPUS）；全自动免染凝胶成像分析系统（Bio-Rad）。
1.3主要试剂
圣草次苷（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），CCK-8细胞活力/毒性试剂（南京凯基生物科技发展有限公司）。p-JNK、p-ERK、p-P38MAPKs抗体（Santa Cruz）。E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9、PARP、Pro-caspase3和β-actin抗体（CST）。DAPI（Sigma）。DCFH-DA探针、二抗（HRP山羊抗兔二抗、HRP山羊抗鼠二抗）（碧云天）。
1.4CCK-8法检测细胞活力
将SMMC-7721细胞接种于96孔板，分别加入圣草次苷（0、25、50、100、150、200、250、300μg/mL）处理24h后，加入CCK-8稀释液（用DMEM完全培养基按照1：10比例稀释），在37℃、5%CO2培养箱中避光孵育2h，振荡10min，全波长酶标仪测定450nm处的吸光度，计算细胞增殖率。
细胞活力=
A
实验组
-A
空白组
A
空白组
-A
空白组
×100%
1.5细胞划痕实验
将伤口愈合2孔硅胶插件（Ibidi）置于12孔板上，将细胞接种于插件的2孔，细胞全长满后拔出插件获得宽度一致的划痕，用PBS溶液洗涤3次，除去未贴壁的细胞，加入含10%胎牛血清的1640完全培养液。不同浓度的圣草次苷（100、200、300μg/mL）处理细胞，在37℃下放入含有5%CO2的培养箱中继续培养后分别在0、24、48、72h的倒置显微镜下收集图像。
1.6细胞迁移实验
24孔板的各孔中添加500μL含有20%胎牛血清的DMEM培养基，把SMMC-7721细胞悬液和圣草次苷混合添加到24孔Transwell插件中（每插件200μL无血清DMEM培养液）、在5%CO2、37℃条件下孵育，弃去小室内的培养基，用棉签清洗细胞，将非迁移、入侵的细胞从膜顶部移除，放入4%多聚甲醛固定后，用1%结晶紫染，取出小室，PBS清洗后，倒置显微镜观察计数拍照。
1.7克隆形成实验
将SMMC-7721细胞接种到6孔板中，细胞贴壁后加入100、200、300μg/mL的圣草次苷处理细胞，在37℃、5%CO2的加湿环境中孵育约2周后，细胞集落数≥20时，用PBS清洗6孔板，用4%多聚甲醛室温固定集落30min，PBS洗3遍，然后在室温下用0.1%结晶紫染5min后，在光镜下计数细胞集落的数量并拍照。
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1.8DAPI
染用不同浓度的圣草次苷处理24h ，PBS 洗涤细胞，用4%多聚甲醛固定30min ，PBS 洗涤3次，DAPI 遮光染5min ，PBS 洗涤3次，使用荧光显微镜观察细胞并拍照。
1.9Western blot 检测蛋白表达量
用圣草次苷处理SMMC-7721细胞后，弃去细胞培养液，使用PBS 清洗1遍，用含有蛋白酶抑制剂的RIPA 缓冲液（Beyotime ）4℃裂解30min ，提取各组细胞总蛋白。取等量蛋白样品，10%SDS-PAGE 电泳分离、转膜、封闭后，在相应的蛋白一抗4℃下过夜，加入二抗室温2h 摇动孵化（1:10000），发光成像系统检测实验结果、Image J 软件分析。
1.10DCFH-DA 荧光探针法检测ROS 水平
将对数生长期SMMC-7721细胞接种于12孔板，贴壁后，将每孔1mL 最终浓度为50μL/mL DCFH-DA 探针，避光温育1h 。按照实验方案，分别用圣草次苷（100、200、300μg/mL ），N-乙酰-半胱氨酸（NAC ）（30μmol/L ）单独或共处理细胞0、15、30、60min 后，用无血清培养液避光清洗3次，去除游离的DCFH-DA 探针，荧光倒置显微镜（Olympus ）下观察细胞内荧光强度。
1.11统计学方法
实验数据分析采用GraphPad Prism 8软件，统计方法两组间比较采用Student t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，P <0.05表明差异具有统计学意义。2结果
2.1圣草次苷抑制SMMC-7721细胞增殖和集落形成
不同浓度（0、25、50、100、150、200、250、300μg/mL ）圣草次苷处理肝癌细胞SMMC-772124h ，使用CCK-8法测定细胞活力。结果表明：从100μg/mL 剂量组开始，圣草次苷能够抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖，300μg/mL 组细胞活力值降低到28%（图1A ）。根据CCK-8法实验结果，圣草次苷对肝癌细胞SMMC-7721存活率影响的IC 50值为215.7μg/mL （图1A ），并且同等剂量下，圣草次苷对肝正常细胞L02没有影响（图1B ）。基于此我们围绕IC 50值选择100、200、300μg/mL 的药物浓度
值作为后续试验的低、中、高剂量组。此外，克隆形成实验表明，在圣草次苷处理组，SMMC-7721细胞集落形成的数量和大小显著降低，圣草次苷有效地降低了SMMC-7721细胞的克隆形成（图2）。
图1CCK-8法测定圣草次苷对肝癌细胞SMMC-7721和肝正常细胞L02存活率的影响
Fig.1Effect of eriocitrin on survival rate of SMMC-7721(A )and L02(B )cells (n =5).**P <0.01vs Eriocitrin (0μg/mL group).
**
**
**
**
**
**
25
50
100150200250300
Eriocitrin (μg/mL)
120
100806040200
C e l l v i a b i l i t y (%o f c o n t r o l )
SMCC-7721
IC 50=215.7μg/mL
L02
25
50
100150200250300
Eriocitrin (μg/mL)
120100806040200
C e l l v i a b i l i t y (%o f c o n t r o l )
A
B
2.2圣草次苷抑制SMMC-7721细胞迁移
划痕实验结果表明，对照组细胞的划痕，72h 后基本愈合，不同浓度的圣草次苷显著抑制SMMC-7721细胞的迁移。统计划痕愈合面积表明，在24、48和72h 这3个检测时间点，圣草次苷处理组与对照组相比，划痕愈合率明显降低（图3）。Transwell 染结果显示，圣草次苷3个剂量组的跨膜细胞数均少于对照组，300μg/mL 组达到最大抑制效果（图4）。
我们进一步检测了迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9、E-cadherin 和N-cadherin 的表达水平。结果显示，圣草次苷能够下调MMP-2、MMP-9和N-cadherin 的蛋白水平，而E-cadherin 表达明显升高（图5）。
2.3圣草次苷诱导SMMC-7721细胞凋亡
分别用100、200、300μg/mL 圣草次苷处理SMMC-7721细胞，随着药物浓度的上升，Pro-caspase 3蛋白表达降低，PARP 蛋白切割显著增加（图6）。DAPI 染结果显示，对照组和药物组细胞核均蓝染，核形态呈椭圆形。圣草次苷处理后，出现蓝高亮区，偶见凋亡小体，呈现典型的凋亡细胞核形态改变（图7）。
2.4圣草次苷抑制SMMC-7721细胞ROS 产生
用DCFH-DA 荧光探针法检测细胞内ROS 生成量，发现圣草次苷在15min 开始刺激内源性ROS 的生
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***
***
***200150100500
C o l o n y n u m b e r
100200300
ERI (μg/mL)
Control
100
200
300
图2圣草次苷抑制SMMC-7721细胞增殖
Fig.2Eriocitrin inhibits SMMC-7721cell proliferation.n =3,***P <0.001vs 0μg/mL group.(0.1%crystal violet solution
staining).
ERI (μg/mL)
Control
100
200
300
0h
24h
48h
72h
**
***150
100
50
W o u n d h e a l i n g r a t e (%)
100200
300
******
********
****
图3圣草次苷抑制SMMC-7721细胞划痕的愈合能力
Fig.3Eriocitrin inhibits scratch healing of SMMC-7721cells (Original magnification:×200).n =3,**P <0.01,***P <0.001vs 0μg/mL group.
24h 48h 72
h
Control ERI (100μg/mL)
ERI (200μg/mL)ERI (300μg/mL)
**
***
150100
500
R e l a t i v e m i g r a t i o n r a t e (%)
100200300
*
图4圣草次苷抑制SMMC-7721细胞的迁移能力
Fig.4Eriocitrin inhibits migration ability of SMMC-7721cells (×200).n =3,*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001vs 0μg/mL group.(0.1%crystal violet solution staining).
www.j-smu J South Med Univ,2023,43(3):412-419Eriocitrin (μg/mL)
Eriocitrin (μg/mL)
Eriocitrin (μg/mL)·
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成，细胞内绿荧光信号增强，30min 达到最大生成量，60min 生成减少，接近本底水平。不同剂量的圣草次苷刺激SMMC-7721细胞，均能有效诱导ROS 的生成，在300μg/mL 组细胞内绿荧光强度最高，ROS 清除剂NAC 能够逆转圣草次苷诱导生成的ROS （图8）。2.5圣草次苷激活MAPKs 信号通路
Western blot 结果显示，ERK 和P38在5min 被圣草次苷激活，60min 磷酸化水平达到最大值，JNK 在30min 被圣草次苷激活，60min 磷酸化水平达到峰值。分别用ERK 抑制剂U0126，JNK 抑制剂SB203580，P38抑制剂SP600125和圣草次苷共处理细胞后，发现ERK 抑制剂
U0126和JNK 抑制剂SB203580能够增强圣草次苷诱
导的PARP 切割，而P38抑制剂SP600125部分抵消圣草次苷对PARP 切割的诱导（图9）。3讨论
圣草次苷是一种类黄酮化合物，具有抗癌、抗氧化和抗脂肪变性等药理作用，其生物活性、作用机制和药代动力学已成为近年来的研究热点［10］。细胞增殖异常被认为是癌症的主要特征之一，而细胞周期的失调是细胞异常增殖的关键因素，有研究表明，圣草次苷具有引起细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡的能力，
可以通过激活
Eriocitrin (μg/mL)
100
200
300
E-cadherin
N-cadherin MMP-2MMP-9β-actin
*****
R e l a t i v e p r o t e i n l e v e l
100200300
***
******
**2.0
1.51.00.50
*E-cadherin/β-actin N-cadherin/β-actin MMP-2/β-actin MMP-9/β-actin
图5圣草次苷对侵袭相关蛋白的影响
Fig.5Effect of eriocitrin on protein levels of MMP-2,MMP-9,N-cadherin,and E-cadherin.n =3,*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001vs
control.
ERI (μg/mL)
100
200
300
PARP
Pro-caspase 3
β-actin R e l a t i v e m i g r a t i o n c e l l s (%)
1
Pro-caspase 3/β-actin Cleaved PARP/β-actin
***
***
100200300
图6圣草次苷诱导SMMC-7721细胞的凋亡
Fig.6Eriocitrin induces SMMC-7721cell apoptosis.Protein levels of PARP and Pro-caspase 3were detected by Western blotting.n =3,***P <0.001vs control.
图7圣草次苷引起SMMC-7721细胞核形态的变化
Fig.7Eriocitrin caused changes in SMMC-7721nuclear morphology (DAPI staining,×
200).
Control ERI (100μg/mL)ERI (200μg/mL)ERI (300μg/mL)
***
***
***
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Eriocitrin (μg/mL)
Eriocitrin (μg/mL)
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