网络出版时间：２０２３－０６－０９０８：３５：０９ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ２／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２３０６０８．１３４４．０４０．ｈｔｍｌ
◇肾脏药理学◇
Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路通过调控ＲＯＳ／ＮＬＲＰ３对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞上皮间充质转化的影响
黄太平，王 菁，徐焕雨，杨 佳，薛 媛，张婷婷，田继华
（山西医科大学微生物学与免疫学教研室，山西太原 ０３０００１）
收稿日期：２０２２－１２－２８，修回日期：２０２３－０３－２７
基金项目：山西省自然科学基金资助项目（Ｎｏ２０１９０１Ｄ１１１１８８）；山
西省回国留学人员科研资助项目（Ｎｏ２０２１ ０７９）
作者简介：黄太平（１９９５－），女，硕士生，研究方向：肾病免疫，Ｅ
ｍａｉｌ：ｔａｉｐｉｎｇｈｕａｎｇ７７＠１６３．ｃｏｍ；
田继华（１９７６－），女，博士，副教授，研究方向：临床免疫，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｊｉｈｕａｔｉａｎ４２９＠１６３．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２２０５００８
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０６－１１４３－０６中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ３２２ ６１；Ｒ３９２ １１；Ｒ３９４ ２；Ｒ６９２ ３９
摘要：目的 探究Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞上皮间充质转化（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＥＭＴ）的影响及其可能的作用机制。方法 采用不同浓度葡萄糖处理细胞，
ＥＬＩＳＡ法检测细胞内Ｓ１Ｐ表达，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测Ｓ１ＰＲ１蛋白表达；将细胞分为正常对照组、ＨＧ组及ＨＧ＋ｓｉＳ１ＰＲ１组，ＲＴ ＰＣＲ检测细胞Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｖｉ ｍｅｎｔｉｎ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ及ＴｗｉｓｔｍＲＮＡ的表达，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ、α ＳＭＡ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ及ＮＦ κＢ蛋白表达，流式细胞术检测活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）水平；将细胞分为正常对
照组、Ｓ１Ｐ组及Ｓ１Ｐ＋ｓｉＳ１ＰＲ１组，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｓｎａｉｌ、α ＳＭＡ、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ及ＮＦ κ
Ｂ蛋白表达，荧光显微镜测定ＲＯＳ水平。结果 ＥＬＩＳＡ结果显示，高糖刺激下细胞内Ｓ１Ｐ含量明显升高。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示，３０ｍｍｏｌ·Ｌ－１
浓度时Ｓ１ＰＲ１蛋白表达量与对照组相比明显升高；阻断Ｓ１ＰＲ１后可以抑制高糖诱导的Ｆｉｂｒｏｎｅ ｃｔｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ及ＴｗｉｓｔｍＲＮＡ表达，上调Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎｍＲＮＡ的表达，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示，Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表达升高，Ｖｉｍ ｅｎｔｉｎ，α ＳＭＡ蛋白表达下降，同时可抑制细胞内ＲＯＳ的产生和ＮＬＲＰ３，ＡＳＣ，ＮＦ κＢ蛋白水平；加入Ｓ１Ｐ激活剂后细胞内ＲＯＳ水平，Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α ＳＭＡ、Ｓｎａｉｌ、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ及ＮＦ κＢ蛋白水平表达均升高，阻断Ｓ１ＰＲ１后表达均降低。结论 高糖能诱导肾小管上皮细胞Ｅ
ＭＴ，其机制可能与Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路作用于ＲＯＳ／ＮＬＲＰ３轴有关。
关键词：Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路；ＲＯＳ；ＮＦ κＢ；ＮＬＲＰ３；上皮间充质转化；肾小管上皮细胞
开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
糖尿病肾病（ｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ，ＤＮ）是糖尿病相关的一种微血管并发症，其主要病理特点表现为肾小球基底膜增厚、结节性肾小球硬化、系膜基质扩张和小动脉透明质化，约３０％～４０％的糖尿病患
者可并发ＤＮ，严重影响患者的生存及预后［１］
。ＤＮ
的发病机制目前尚不清楚，但肾小管间质纤维化被普遍认为是导致ＤＮ患者肾功能丧失的重要途径。已有研究证实，上皮间充质转化（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｅｓｅｎ ｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＥＭＴ）可介导肾纤维化中细胞外基
质（
ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）的积累和沉积［２］
。然而，肾小管ＥＭＴ在ＤＮ早期进展中的分子机制仍未知。
鞘氨醇１ 磷酸（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ １ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，Ｓ１Ｐ）是一种中枢鞘脂分子，可以与１ 磷酸鞘氨醇受体（Ｓ１ＰＲ１ ５）结合，从而调节多种重要的细胞反应，包括增殖和迁移，并根据其作用部位调节炎症和纤维
化反应［３］。近年来，Ｓ１Ｐ在肾脏纤维化中发挥的作
用受到越来越多的关注，研究发现水蛭素可以通过Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ２／Ｓ１ＰＲ３信号通路抑制蛋白酶激活受体１表达，从而减轻ＴＧＦ β诱导的肾近端肾小管上皮细
胞纤维化［４］。另有研究指出，激活Ｇ蛋白偶联胆汁
酸受体（ｔａｋｅｄａ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ ５，ＴＧＲ５）可以抑制肾小球系膜细胞中Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ２信号通路并抵抗高
糖诱导的纤维化［５］。然而，Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１在高糖诱导
的肾小管上皮细胞的表达及其与ＥＭＴ的关系尚未见报道，因此我们探究了Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路在高糖诱导的ＮＲＫ ５２Ｅ大鼠肾小管上皮细胞ＥＭＴ中的作用机制。１ 材料与方法
１．１ 材料 ＮＲＫ ５２Ｅ细胞购自中国科学院上海细胞库；优质胎牛血清（Ｗ０００１００）购于上海四季青公司；胰蛋白酶（Ｓ０１４０２）购自北京索莱宝生物科技有限公司；ＤＭＥＭ低糖培养基（Ｃ１１８８５５００ＢＴ）购自美国Ｇｉｂｃｏ公司。Ｓ１Ｐ酶联免疫吸附测定试剂盒（ＭＭ ４４７７８Ｍ１）购自江苏酶免实业有限公司；ＲＯＳ
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３４１１·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊｕｎ；３９（６）：１１４３～８
测定试剂盒（Ｅ００４ １ １）购自南京建成生物科技有限公司；ＢＣＡ蛋白定量试剂盒（ＫＧＰＢＣＡ）购自江苏凯基生物技术股份有限公司；超敏ＥＣＬ化学发光检测试剂盒（ＳＷ１３４ ０１）购自赛文创新北京生物科技有限公司；Ｓ１Ｐ（ＳＭＬ２７０９）购自Ｓｉｇｍａ公司；逆转录（ＲＲ０４７Ａ）、ＰＣＲ试剂盒（ＲＲ８２０Ａ）购自ＴａＫａＲａ公司；小干扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、引物Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｖｉｍｅｎ ｔｉｎ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ及Ｔｗｉｓｔ购自上海生物工程公司；兔抗Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＷＬ０１４８２）、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（ＷＬ０１９６０）、Ｆｉ ｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＷＬ００７１２）及Ｓｎａｉｌ（ＷＬ０１８６３）抗体购自沈阳万类生物科技有限公司；兔抗ＮＦ κＢ（ａｂ２０７２９７）、ＮＬＲＰ３（ａｂ２６３８９９）、ＡＳＣ（ａｂ１８０７７９）及β ａｃｔｉｎ（ａｂ８２２６）抗体购自Ａｂｃａｍ公司。
１．２ 细胞培养 ＮＲＫ ５２Ｅ细胞置于３７℃、５％二氧化碳培养箱中，使用含５％胎牛血清及ｌ％双抗（１００ｋＵ·Ｌ－１青霉素和１００ｋＵ·Ｌ－１链霉素）的ＤＭＥＭ培养液培养，用胰蛋白酶消化，２ｄ传代１次。
１．３ 细胞分组与处置 将ＮＲＫ ５２Ｅ细胞分为４组：正常对照组（ｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌ，
ＮＣ），１０、２０及３０ｍｍｏｌ·Ｌ－１葡萄糖浓度组，ＮＣ组细胞用低糖培养，分别作用２４和４８ｈ。
将ＮＲＫ ５２Ｅ细胞分成３组：ＮＣ组、ＨＧ组（３０ｍｍｏｌ·Ｌ－１葡萄糖）、ＨＧ＋ｓｉＳ１ＰＲ１组（转染ｓｉ Ｓ１ＰＲ１４８ｈ后加入３０ｍｍｏｌ·Ｌ－１葡萄糖刺激２４ｈ）。
将ＮＲＫ ５２Ｅ细胞分为３组：ＮＣ组、Ｓ１Ｐ组、Ｓ１Ｐ＋ｓｉＳ１ＰＲ１组（转染ｓｉ Ｓ１ＰＲ１４８ｈ后用５μｍｏｌ·Ｌ－１Ｓ１Ｐ激活剂作用１２ｈ）。
１．４ ＲＯＳ水平测定 ＮＲＫ ５２Ｅ细胞接种于６孔板（５×１０４个细胞／孔），２４ｈ后收集细胞，ＤＣＦＨ ＤＡ作为荧光探针检测细胞内ＲＯＳ水平，孵育３０ｍｉｎ后，ＰＢＳ洗涤，收集细胞后通过流式细胞仪检测或倒置荧光显微镜拍照。
１．５ ＥＬＩＳＡ法测定Ｓ１Ｐ浓度 细胞用不同浓度葡萄糖作用２４ｈ或４８ｈ，细胞沉淀用超声破碎仪破碎，１０００ｒ·ｍｉｎ－１，４℃离心收集上清，根据ＥＬＩＳＡ试剂盒说明书测定Ｓ１Ｐ表达水平。
１．６ 细胞转染 细胞达到３０％～４０％融合后，按照说明书用ｓｉＲＮＡ在无血清培养基中转染ＮＲＫ ５２Ｅ。转染ｓｉＲＮＡ４８ｈ后进行下一步处理。
１．７ ＲＴ ｑＰＣＲ检测Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｆｉ ｂｒｏｎｅｃｔｉｎ及Ｔｗｉｓｔ的ｍＲＮＡ表达 用ＴＲＩｚｏｌ提取总ＲＮＡ，溶解在无ＲＮＡ酶水中。反转录为ｃＤＮＡ后采用实时荧光定量ＰＣＲ检测基因表达。反应条件：９５℃，３０ｓ；９５℃，５ｓ；６０℃，３５ｓ；共４０个循环。采用２－ΔΔＣｔ分析法计算ｍＲＮＡ相对浓度。引物如下：ＧＡＰＤＨ：上游５′ ＴＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＧ ３′，下游５′ ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ ３′；Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ：上游５′ ＧＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧ ３′，下游５′ ＣＴＣＧＧＡＣＡＣＴＴＣＣＡＣＴＣＴＣＴＴＴ ３′；Ｖｉｍｅｎｔｉｎ：上游５′ ＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＴＴＧＣＣＧＴＴＧＡＡＧ ３′，下游５′ ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＧＡＧＣＣＡＴＴＴＣ ３′；Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ：上游５′ ＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＧＧＴＴＴＴＡＡＣＴＧ ３′，下游５′ ＡＧ ＧＡＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣ ３′；Ｔｗｉｓｔ：上游５′ ＧＣＡＡＧＡＡＧＴＣＧＡＧＣＧＡＡＧＡＴ ３′，下游５′ ＧＣＴＣＴＧ ＣＡＧＣＴＣＣＴＣＧＡＡ ３′。
１．８ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测相关蛋白的表达 使用裂解液提取细胞总蛋白后采用ＢＣＡ法检测蛋白浓度，通过ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳分离蛋白，将目的蛋白转至ＰＶＤＦ膜，５％脱脂奶粉室温封闭２ｈ，ＴＢＳＴ洗膜后分别加入一抗Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ（１∶１０００）、α ＳＭＡ（１∶１０００）、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（１∶１０００）、Ｓｎａｉｌ（１∶１０００）、ＮＬＲＰ３（１∶１０００）、ＡＳＣ（１∶１０００）、ＮＦ κＢ（１∶１０００）和β ａｃｔｉｎ（１∶１００００），于４℃条
件下过夜孵育，ＴＢＳＴ洗膜后加入羊抗兔抗体（１∶１００００）室温孵育１ｈ，ＴＢＳＴ洗膜后使用ＥＣＬ化学发光试剂盒显影，使用ＩｍａｇｅＪ分析蛋白的相对表达量。
１．９ 统计学处理 所有数据均以珋ｘ±ｓ表示，各组间差异由方差齐性和单因素方差分析确定，使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６ ０软件进行统计学分析。
２ 结果
２．１ 高糖刺激对Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路表达的影响 为了探究高糖刺激对Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路的影响，ＥＬＩＳＡ法检测高糖作用２４ｈ和４８ｈ后细胞内Ｓ１Ｐ的表达，与ＮＣ组相比３０ｍｍｏｌ·Ｌ－１组Ｓ１Ｐ表达明显升高（Ｐ＜０ ０１）。不同浓度葡萄糖刺激ＮＲＫ ５２Ｅ细胞２４ｈ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示，随着葡萄糖浓度升高，Ｓ１ＰＲ１蛋白表达逐渐升高，３０ｍｍｏｌ·Ｌ－１组与ＮＣ组相比差异具有统计学意义（Ｐ＜０ ０５），提示高糖可以激活ＮＲＫ ５２Ｅ细胞中Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路的表达（Ｆｉｇ１）。
２．２ 阻断Ｓ１ＰＲ１对高糖诱导的ＮＲＫ ５２ＥＥＭＴ的影响 ＲＴ ｑＰＣＲ结果显示，高糖处理显著降低了Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎｍＲＮＡ的表达，阻断Ｓ１ＰＲ１后表达升高（Ｐ＜０ ０５），与ＮＣ组相比，高糖组Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃ ｔｉｎ及ＴｗｉｓｔｍＲＮＡ表达升高，阻断Ｓ１ＰＲ１后基因表达降低（Ｐ＜０ ０５）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果也显示，阻断Ｓ１ＰＲ１
后Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ表达升高（Ｐ＜０ ０５），α ＳＭＡ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白表达降低（Ｐ＜０ ０５，Ｐ＜０ ０１），表明高糖刺激可以诱导ＮＲＫ ５２Ｅ细胞发生ＥＭＴ，而阻断
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·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊｕｎ；３９（６）
Ｆｉｇ１ ＥｆｆｅｃｔｏｆｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１ｉｎＮＲＫ ５２Ｅｃｅｌｌｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
１：ＮＣ；２：１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１；３：２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１；４：３０ｍｍｏｌ·Ｌ－１
．Ａ，
Ｂ：ＴｈｅｌｅｖｅｌｏｆＳ１ＰｉｎｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＥＬＩＳＡ；Ｃ，Ｄ：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｄｅ
ｔｅｃｔｅｄｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＳ１ＰＲ１ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ＜０ ０５，
Ｐ＜０ ０１ｖｓＮＣ．
Ｓ１ＰＲ１后可显著改善ＥＭＴ，提示Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１通路与ＥＭＴ有关（Ｆｉｇ２）。
２．３ 阻断Ｓ１ＰＲ１对高糖诱导的ＲＯＳ水平的影响 如Ｆｉｇ３流式细胞术检测结果所示，与ＮＣ组相比，高糖刺激后细胞内ＲＯＳ表达升高，差异具有统计学意义（Ｐ＜０ ０１），表明高糖刺激可以激活细胞内ＲＯＳ的产生；与高糖组相比，阻断Ｓ１ＰＲ１后ＲＯＳ表达降低（Ｐ＜０ ０１），提示高糖诱导的ＮＲＫ ５２Ｅ细胞Ｒ
ＯＳ的产生是由Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路介导的。２．４ 阻断Ｓ１ＰＲ１对高糖诱导的ＮＦ κＢ／ＮＬＲＰ３信号通路的影响 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明，与ＮＣ组相比，高糖诱导下ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ及ＮＦ κ
Ｂ
蛋白表达升Ｆｉｇ２ ＥｆｆｅｃｔｏｆｂｌｏｃｋｉｎｇＳ１ＰＲ１ｏｎＮＲＫ ５２ＥＭＴ
ｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
Ａ：ＲＴ ｑＰＣＲｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥ ｃａｄｈｅｒｉｎ，Ｖｉ ｍｅｎｔｉｎ
，ＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｏｎａｎｄＴｗｉｓｔ；Ｂ，Ｃ：ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｏｆＥ ｃａｄｈｅｒｉｎ，α
ＳＭＡａｎｄＶｉｍｅｎｔｉｎｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ； Ｐ＜０ ０５，
Ｐ＜０ ０１ｖｓＮＣ，＃Ｐ＜０ ０５，＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓＨＧ．
高（Ｐ＜０ ０１），阻断Ｓ１ＰＲ１后表达降低，与高糖组相比差异具有统计学意义（
Ｐ＜０ ０５），说明阻断Ｓ１ＰＲ１可以抑制高糖作用下炎症信号的产生（Ｆｉｇ４）。
２．５ Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１激活ＲＯＳ／ＮＬＲＰ３促进ＮＲＫ ５２ＥＥＭＴ 免疫荧光结果表明，与ＮＣ组相比，激活Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路ＲＯＳ水平表达升高（Ｐ＜０ ０１），阻断Ｓ１ＰＲ１后可明显降低ＲＯＳ的表达（Ｐ＜０ ０５）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示，阻断Ｓ１ＰＲ１可以降低Ｓ１Ｐ刺激下Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α ＳＭＡ、Ｓｎａｉｌ、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ及ＮＦ κＢ蛋白表达（Ｐ＜０ ０５），提示Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１可能通过激活ＲＯＳ／ＮＬＲＰ３促进ＮＲＫ ５２ＥＥＭＴ（Ｆｉｇ５）。３ 讨论
ＤＮ是糖尿病常见的微血管并发症，因其发病
·５
４１１·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊｕｎ；３９（６）
Ｆｉｇ３ ＥｆｆｅｃｔｏｆｂｌｏｃｋｉｎｇＳ１ＰＲ１ｏｎＲＯＳｌｅｖｅｌｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
Ａ，Ｂ：ＲＯＳｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；
Ｐ＜０ ０１ｖｓＮＣ，＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓＨＧ
．
Ｆｉｇ４ ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｂｌｏｃｋｉｎｇＳ１ＰＲ１ｏｎＮＦ κＢ，ＮＬＲＰ３ａｎｄＡＳＣｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）Ａ，Ｂ：ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｏｆＮＬＲＰ３，ＡＳＣａｎｄＮＦ κＢｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ；
Ｐ＜０ ０１ｖｓＮＣ，＃
Ｐ＜０ ０５，＃＃
Ｐ＜０ ０１ｖｓＨＧ．
机制复杂，缺乏有效的诊断和方法，目前仍是造成糖尿病患者终末期肾病的主要原因
［１］
。由于高
糖、尿蛋白、氧化应激的存在，肾小管上皮细胞转化为肌成纤维细胞来抵抗环境破坏，然后进入间质，异
常合成ＥＣＭ［６］
，最终导致肾小球基底膜增厚、足细
胞消失、肾小球内结节性ＥＣＭ积聚以及肾小管间质
纤维化［
７］
。ＥＭＴ已被证实是上皮细胞失去上皮细胞特征而获得间充质特征的严密调控过程，因此，预防ＥＭＴ的发生发展是延缓小管间质损伤，减少肌成纤维细胞数量的主要措施。
Ｓ１Ｐ被证明可参与肾脏中多种细胞功能的调节，如细胞增殖和生存、迁移、炎症反应及ＥＣＭ重塑等。Ｓ１Ｐ的大部分生物学功能是基于其与５种特异
性细胞表面Ｓ
１ＰＲＳ的结合［８］
。研究表明，Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ２信号通路的激活与ＤＮ的发生和纤维化有
关［９］
，但未曾见Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路在ＤＮ中的报
道，因此我们首先探究了在高糖诱导下大鼠肾小管上皮细胞中Ｓ
１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路的表达。结果显示在高糖诱导的肾小管上皮细胞中Ｓ
１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路表达明显升高，提示Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路可能与ＤＮ相关。有研究指出鞘氨醇激酶（ＳｐｈＫ１和ＳｐｈＫ２）催化鞘氨醇磷酸化生成Ｓ１Ｐ，敲除Ｓｐｈｋ１可
减轻单侧输尿管梗阻模型肾纤维化［１０］，Ｓ１ＰＲ１也可
通过ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路抑制缺血／再灌注损伤所致的肾
ＥＭＴ［１１］。基于此我们检测了高糖刺激后ＥＭＴ相关
指标的基因及蛋白水平表达，结果显示，阻断Ｓ１ＰＲ１可以抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞ＥＭＴ，提示Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路可能与ＤＮ的ＥＭＴ有关。
那么Ｓ
１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路是如何影响ＤＮ的ＥＭＴ呢？越来越多的证据表明，炎症与ＤＮ的发展
密切相关，其中ＮＬＲＰ３炎症小体在介导ＤＮ肾损伤
中的机制被广泛研究［１２］。在ＤＮ中，高脂高糖导致
ＲＯＳ、ＴＧＦ β１等因子水平升高，进而诱导肾小管上皮细胞发生ＥＭＴ，慢性肾小管间质纤维化和炎症反
应［１３］。黄葵胶囊通过抑制ＮＬＲＰ３炎症小体激活和ＴＬＲ４／ＮＦ κ
Ｂ信号通路，减轻ＤＮ的ＥＭＴ［１４］，高血糖可通过ＲＯＳ激活ＮＬＲＰ３炎症小体，诱导肾小管
间
质损伤和纤维化［１５］
。因此，我们猜测Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１
信号通路可能是通过参与氧化应激、炎症来调控高糖诱导的肾损伤与纤维化。
有研究指出，高氧诱导的细胞胞质调节蛋白激活和ＲＯＳ的产生是通过Ｓ１Ｐ转运蛋白Ｓｐｎｓ２和
Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１，２信号轴介导的［１６］。因此，我们检测了
在高糖诱导的肾小管上皮细胞中Ｓ
１ＰＲ１和ＲＯＳ是否存在联系，在阻断Ｓ１ＰＲ１后发现ＲＯＳ表达减低，提示在高糖诱导的肾小管上皮细胞中，Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路可以激活ＲＯＳ。
·
６４１１·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊｕｎ；３９（６）
Ｆｉｇ５ ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｂｌｏｃｋｉｎｇＳ１ＰＲ１ｏｎＲＯＳ，ＥＭＴａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓｕｎｄｅｒＳ１Ｐｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
Ａ，Ｂ：ＲＯＳｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；Ｃ，Ｄ：ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｏｆＶｉｍｅｎｔｉｎ，α ＳＭＡ，Ｓｎａｉｌ，ＮＬＲＰ３，ＡＳＣａｎｄＮＦ κ
Ｂｗｅｒｅｄｅｔｅｃ ｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
； Ｐ＜０ ０５，
Ｐ＜０ ０１ｖｓＮＣ，＃Ｐ＜０ ０５，＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓＳ１Ｐ． 另有研究报道，果糖可下调ｍｉＲ ３３０表达，增加ＳｐｈＫ１／Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１／３信号通路，进而激活ＮＦ κＢ／ＮＬＲＰ３炎症小体产生ＩＬ １β，导致胰岛素信号通路受损［１７］
。同时，
Ｓ１ＰＲ１可通过激活ＮＬＲＰ３炎症小体和ＩＬ １β通路引起机械过敏［１８］
。提示Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路与ＮＦ κＢ／ＮＬＲＰ３炎症小体激活具有相关性。在本研究中发现，阻断Ｓ１ＰＲ１后可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞中ＮＦ κＢ／ＮＬＲＰ３炎症小体的表达。而使用Ｓ１Ｐ激动剂作用于肾小管上皮细胞后，其结果与高糖刺激相同，因此我们认为Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１通路通过作用于ＲＯＳ／ＮＬＲＰ３轴从而促进肾小管上皮细胞ＥＭＴ的产生。
综上所述，本研究证实Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路在高糖刺激下表达升高，且高糖诱导ＮＲＫ ５２Ｅ细胞ＥＭＴ的产生，其作用机制可能是Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路通过ＲＯＳ／ＮＬＲＰ３轴促进ＮＲＫ ５２Ｅ细胞ＥＭＴ进而导致肾脏纤维化。Ｄ
Ｎ目前较为困难，进一步研究Ｓ１Ｐ／Ｓ１ＰＲ１信号通路在肾间质纤维化中的作用机制，有望能够为糖尿病肾脏疾病提供新的方向。因此，探索肾纤维化的新靶点和方法对预防和ＤＮ具有重要意义。参考文献：
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７４１１·中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２３Ｊｕｎ；３９（６）
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