第46卷第2期2221年2月
贵州医科大学学报
Vol. 46 No. 4
JOURNALOFGUIZHOU  MEDICALUNIVERSITY
2021 4
2家蝇抗真菌肽-1A 对人肝癌细胞HepG2抑制作用的
机制*
** ［基金项目］国家自然科学基金（81360254）；贵州省科技计划项目［黔科合平台人才（2018）5799 -22］；贵州省科技计划项目［黔科合支撑（2020）4Y236］* *通信作者 E-mail ：8625017/3@qq. com ； 772608275 @qq. com
吴坤马晓琳8，张迎春1邓思波黄敏慧1，
，吴建伟1陈峥宏王涛
(.贵州医科大学基础医学院，贵州贵阳550525； 2.贵州省普通高等学校病原生物学特重点实验室，贵州贵阳550525； 8.济南金 域医学检验中心，山东济南250002)
［摘要］目的探究家蝇抗真菌肽-1A  (MAF-1A )对人肝癌细胞HepG2抑制作用的机制。方法采用原核
串联表达及镍柱亲和层析法制备MAF-1A ；取人肝癌细胞HepG2进行传代培养，采用透射电镜技术，观察不同浓
度MAFPA(2、52、102 m/L)作用细胞HepG2细胞24 h 后对细胞超微结构的影响；采用流式细胞术检测MAF-
1A(2、1O2、2O2及442 m/L)作用HepG2细胞24 h 后的细胞周期、细胞内ROS 水平及细胞凋亡率；以荧光探针
reactive oxygen species (ros)法检测MAFPA(2、102、202及442 m/L)作用HepG2细胞24 h 后的线粒体膜电位。结果 透射电镜结果显示，
MAF-1A 作用后HepG2细胞出现染质边集，核固缩，胞膜出芽、空泡化、形成凋亡小体等形态学变化；流式细胞
术检测结果显示，与2 m/L  MAF-1 A 组比较,MAF-1 A 各浓度组均可使G2/G1期的细胞比例升高(P<2. 21)，细 胞凋亡率明显增高(P<2. 21)，当MAF-1A 浓度达442 m/L 时、细胞内活性氧(ROS )含量明显增多(P<2. 21)；
荧光探针检测发现，与2 m/L  MAF-1 A 组比较,MAF-1 A 可使HepG2细胞的线粒体膜电位显著下降，并且随着
MAF-1A 浓度的升高，线粒体膜电位下降细胞数的占比增高。结论MAF-1A 可能通过促进线粒体膜电位下调、
增加细胞内ROS 含量所介导的细胞凋亡，以及阻滞细胞周期来发挥抑制HepG2细胞的作用。
［关键词］细胞凋亡；细胞周期；膜电位，线粒体；抗菌肽；家蝇抗真菌肽-1A ；肝癌细胞；活性氧
［中图分类号］R735.7 ［文献标识码］A  ［文章编号］2096-8388(2421 )22-213116
DOI ： 10.19367/j. cnki. 2066-8388 2021.02.002
Mecianism  of  inhiVitorc  effeci  of  MAF-1 A  on  human
hepatocellulac  carcinoma  cell  HepG 2
WU  Kuk 1，, MA  Xiaolik 8, ZHANG  Yingchuki , DENG  Sino 1，, HUANG  Minhut 2,
WU  Jianwet 1, CHEN  Zhepnhona 1，, WANG  Tao 1，
((.School  of  Basic  MedicaO  Sciencet , Guizhou  MedicaO  Unwersity , Giuyaag  555055, Guizhou , CCina  ； 5. Kep  Laboratora  af
MedicaO  Pathoued  Biolog, aU  Educatiou  DeparOneni  yf' Guizhou  Provinca , Guiyaag  555055, Guizhou , CCina  ；
3. Jinan  Jinya  Medical  Test  Centm , Jinan  255000, SSangoiig , China)
［Absicci ］ Objective  To  explore  the  mechanism  of  Musca  antifunnal  peptine-1 A  (MAF-
1 A) ok  humak  hepatocellulae  corcikoma  HepG
2 ceUc. MetOodt  MAF-1 A  was  preparep  by  tankem  pronaryot1c  expression  ank  nichel  celumk  aPinite  chromatokranpy ; humak  hepatocellulae  corcikoma  celS  HepG2 was  suucolturep , tOe  effect  o U  differepe  conceptrationc  of  MAF-1 A  (2, 50, 102 mg/L) on  tOe
ultrastrncture  of  HepG2 aftee  24 honrs  was  detectep  by  transmission  electron  micrcocopy; U ow
cytometre  was  usep  to  detect  tOe  o H  cyde , mtracellulae  reactive  oxygep  su ec ies  ( ROS ) level  ank  dpoptosis  raOe  of  HepG2 c HI s  aftee  treatmepe  witO  O  MAF-1 A  (2, 102, 202, ank  442 m/L) foe
24 h  ； tOe  1^0x 0(0100/ membrane  poteptiat  of  HepG2 o H s  treatep  witO  MAF-1 A  (2, 102, 222, ank
442 mg/L) foo  24 h  was  detectep  by  Uuorescept  proke  metOok. Resultt  HepG2 c HI s  sUowep
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贵州医科大学学报46卷
morpholooical cOan/i such a(cOromatin c P/c set,kayopyknosis,buddinn of cell membrann, vacaolization i C formation of dpoptotic b onics aftco MAF-1A treatmeni.Comyarep wii tic contron
/onp(0m/L),tha cell ratio of G0/G1phase wau increasep in pch MAF-1A concentration/onp (P<0.41),ant tha aaoptosie rata wae sionificantlo increasep(_P<0.41).When tha concentration of MAF-1A wae440m/L,tha intracellulao ROS level wae sionificantlo increasep(P<0.01). CompareP witli thv/ronp(0m/L),MAF-1A coni/sionificantlo decrease thv mitocaonn/al membrane potential of HepG2cc
P s,ant witi increase of MAF-1A concentration,th pI•opo/mn of cells witr decreaseP mitocaonn/al membrana potential increasep.Conclusion MAF-1A may play a ala in inCinitinn HepG2cells by promotinn cell dpoptosis mePiateP by downrepulation of mitocaonn/al membrana potential ant increase of intracellulao ROS conteni,as well as blocainn cell cycla.
[Key wordi]dpopmsi(；ceU cycla；membrana hotential,mitocaonn/al；antimicronial pephnv( (AMPs)；Musca domestica antiglnaal pnhnv-1A(MAF-1A)；henatoceUOao carcinoma all；reactive oxy/n spnein(ROS)
抗菌肽（antimicronial pnhdv（,AMP s）是广泛存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害的一类小分子多肽，是生物固有免疫系统的重要组成成分［1-2］0研究发现，AMPs除了具有抑制细菌、病毒等病原微生物作用外，对肿瘤细胞也具有较强的抑制活性卩「6］，而且对机体正常组织细胞的毒副作用较低［7'0］，因此具有抗肿瘤药物开发的潜力。家蝇抗真菌肽-1A（Musca domestica antifpnaal pep-tidn1A,MAF-1A）是来源于家蝇幼虫的小分子阳离子活性多肽，由26个氨基酸残基组成⑼o有研究报道，MAF-1A能杀伤真菌、病毒等致病性微生物［10-11］；课题组前期实验研究发现,MAF-1A能对人肝癌HepG2产生抑制作用，且对人正常肝细胞LO2和红细胞无明显毒性作用，具有进一步研究开发的价值g o但MAF-1A抑制HepG2细胞的作用机制尚不清楚，本研究旨在探讨MAF-1A对HepG2细胞产生抑杀作用的可能因素，为MAF-1A的开发利用提供实验依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株和主要试剂人肝癌细胞HepG2由贵州医科大学生物工程实验室惠赠；杜氏改良伊格尔培养基（dulbecce"s mopifiep eaglv mePium, DMEM）及磷酸盐缓冲液（phosphate buffered sa-1；^,PBS；美国GIBCO），胎牛血清（杭州四季青），活性氧（reactive oxygen species,ROS）检测试剂盒及Annexin V-FIBC试剂盒（北京索莱宝），细胞周期检测试剂盒及线粒体膜电位检测试剂盒（上海碧云天）
2321.1.2主要仪器Nove Cyte流式细胞仪（杭州艾森），田20-4透射电子显微镜（日本日立高新），XDS-1B倒置显微镜（重庆光学），MCO-5M CO2培养箱（日本三洋）及L0台式低速离心机（湖南湘仪）o
1.2方法
1.2.1MAF-1A储备液的制备按文献［13］方法，采用原核载体串联表达MAF-1A，镍柱亲和层析纯化、脱盐浓缩制备MAF-1A，使其储备液浓度为5000m/L，分装后置于-80C冰箱冷藏备用。
1.2.2细胞培养HepG2细胞培养于DMEM完全培养基，含体积分数1%胎牛血清，培养基添加终浓度1200
00U/L青霉素及120m/L的链霉素；将细胞置于5%CO2的37C培养箱中培养，细胞密度达到80%时，按照1：3的比列传代，取处于对数生长期的细胞进行实验。
1.2.3透射电镜观察细胞超微结构取对数生长期的HepG2细胞以1x125个/孔的密度接种于6孔板，置5%CO2的37C细胞培养箱培养12h；0、50及100m/L的MAF-1A分别处理24h后收集细胞,3%戊二醛固定、丙酮逐级脱水、样品包埋，切完片后先后用醋酸铀和枸椽酸染，于透射电镜（6000x）下观察细胞的超微结构。
1.2.2流式细胞术测定细胞周期、细胞凋亡及细胞内ROS取对数生长期的HepG2细胞以1x125个/孔的密度接种于6孔板，每组3个复孔,5%OO 的37C培养箱培养12h；0、、00、200及440m/L的MAF-1A分别处理24h o按试剂盒说明书方法，分别以碘化丙啶（propidium Iodide,PI）、Annexin V-PI 试剂、DCFH-DA（12pnol/L）溶液处理细胞后，再用流式细胞仪分别检测HepG2细胞的周期、凋亡
2期吴坤等 家蝇抗真菌肽-1A 对人肝癌细胞HepG2抑制作用的机制
及细胞内ROS 水平。
1.2.2 JC-1荧光探针检测线粒体膜电位 取对 数生长期的HepG2细胞以1 x  12
*5个/孔的密度接 种于6孔板，放入5% CO 2的87 °C 细胞培养箱培养 1 h ；以终浓度为2、102、202 及
442 m/L  的 MAF-
1A 处理细胞24 h，加入JC-1染工作液混匀， 87 C 孵育22 min，不含胎牛血清的培养基洗涤8
次，胰酶消化,002 r/min 离心8 min 收集细胞，流 式细胞仪检测HepG2细胞线粒体膜电位。2 m/L  MAF-1A  组 55 m/L  MAF-1A  组 12 m/L  MAF-1A  组
注：黑箭头分别表示细胞膜岀芽、核固缩，凋亡小体，白箭头分别表示染质岀现边集，胞浆固缩、空泡化
图1 不同浓度MAF-1A 对HepG2细胞形态的影响(6 002 x )
Fi/. C  Effects  of  different  cokceptrations  of  MAF-1A  on  tOe  morphology  of  HepG2(6 002 x )
12统计学分析
采用SPSS  16.0进行数据分析。计量数据用 均数土标准差&土，表示，组间差异比较用单因素
方差分析,P  <2. 25为差异有统计学意义。
2结果
2.1电镜观察
透射电镜观察可见，经不同浓度的MAF-1A 作
用后,HepG2细胞体积较对照组缩小，细胞膜产生
出芽现象，核固缩，有凋亡小体形成；染质出现边
集，胞浆固缩、空泡化；而阴性对照组细胞规贝0，胞
膜未见形态变化，未见核固缩、胞浆浓缩等现象。
见图1。
22细胞周期
检测结果显示，与2 mg/L 组相比,MAF-1A 各 浓度组中G2/G1期的HepG2细胞比例升高，差异
有统计学意义(P<2.21)。见表1。
表1 不同浓度MAF-1A 对HepG2细胞
周期的影响(±,
Tab. 1 Effects  of  differept  cokceptratioks  of
MAF -1A  on  ceP  cyde  of  HepG2 （（ 土 s ）
MAF11A  浓度
细胞比例/%
G2/G1期
S 期
G2LM  期
0 m/L  组
87. 52 ±2. 06 87. 52 ±1.22
24. 26 ±2 52
10 m/L  组42. 10 ±2 27 ⑴ 39. 85 ±1. 8812. 70 ±0 38202 m/L  组
44. 24 ±2 96 ⑴ 32. 02 ±2 8724. 12 ±2 60
442 m/L  组
46, 38 ±1.38 ⑴ 28. 55 ±2 66
10.66 ±2 88
注：⑴与 2 m/L  MAF-1 A  组比较,P<2. 01。
2.3细胞凋亡率
102、202 及 442 mg/L  的 MAF-1 A  作用 24 h
后,HepG2细胞凋亡率较0 mg/L  MAF-1 A 组明显
增大，且凋亡率随MAF-1A 浓度的升高而增加 (P<0.01)。见图 2。
2 . 2线粒体膜电位
10、200 及 440 mg/L  的 MAF-1A  分别作用
24 h 后，与对照组(2 m/L 组)相比，HepG2细胞的
线粒体膜电位可降低，并且随着MAF-1A 浓度的升 高，出现线粒体膜电位下降细胞数的占比逐渐增 高。见图 8。
2 . 2 ROS
结果显示，与2 m/L  MAF-1A 组相比，高浓度 MAF-1A(442 m/L)组 HepG2 细胞内 ROS  水平明
显升高(P<2.21)，但中、低浓度MAF-1A(122和
202 mg/L)组ROS 水平的差异无统计学意义(P  >
2.05)。见图 4。
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贵州医科大学学报46卷
FITC-H OmgZLMAF-lA组
FITC-H
100mg/L MAF-1A组
FITC-H
200mg/L MAF-1A组
FITC-H
400mg/L MAF—1A组
注:A为凋亡细胞检测结果,B为细胞凋亡率的定量结果；（与0m/L MAF-1A组比较,P<0.01。
图2不同浓度MAF-1A对HpG2细胞凋亡的影响
Ft4EEecis of differeni conceptration（of MAF-1A on dpoptosis of HepG2cc H）
0m/L MAF-1A组100m/L MAF-1A组200m/L MAF-1A组400m/L MAF-1A组
注：正常线粒体膜电位细胞分布于右上Q2-2区域，线粒体膜电位下降的细胞分布在右下Q21区域°
图3不同浓度MAF1A对HpG2细胞线粒体膜电位的影响
Ft1EEecis of differeni cepceptration(of MAF-1A on mitocaonn/a1membrann hoteptia1of HepG2cc H)
3讨论
目前研究认为,AMPs的抗肿瘤机制包括诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、抗血管形成、溶膜作用及改变细胞离子通道等酗"7，其中诱导细胞凋亡是AMPe抑杀肿瘤细胞的主要机制之一[1]o细胞调亡是细胞为更好地适应生长环境而发生的自发的程序性死亡，与肿瘤的发生、发展及密切相关[»2]o文献报道，细胞
在调亡过程中可出现细234胞膜皱缩、细胞膜出芽、细胞核边集、细胞器的碎片及染质的固缩或碎片等特征性的形态学变化[21_22]o本研究的透射电镜检测结果显示, HepG2细胞经MAF-1A作用后，产生了染质聚集或边集，核固缩，形成凋亡小体等细胞凋亡的特征性变化，提示MAF12A抑制肿瘤活性机制作用可能与细胞凋亡相关；进一步通过流式细胞术检测细胞凋亡率发现，不同浓度MAF-1A均可促进HepG2细胞的凋亡，且浓度越高，细胞凋亡率越大（P< 0.01），表明MAF-1A可诱导HepG2
细胞凋亡的发
4期吴坤等家蝇抗真菌肽-1A对人肝癌细胞HepG2抑制作用的机制
100mg/L MAF-1A组200mg/L MAF-1A组400mg/L MAF-IA组
注:A为细胞内ROS检测结果,B为细胞内ROS的定量表达;(8与0my/L MAF-1A组比较,P<0.01。
图4不同浓度MAF-1A对HepG2细胞内ROS的影响
Fig.0Effots of different concextrations of MAF-1A on ROS in HepG2celis
生，提示MAF-1A可以通过诱导HepG2细胞凋亡，从而抑制HepG2细胞的增殖。
细胞凋亡过程受多条信号转导通路的调节，随着对凋亡机制研究的深入，普遍认为线粒体是介导细胞凋亡的执行者，而线粒体膜电位降低是细胞发生凋亡最早期的变化，一旦线粒体膜电位出现降低，细胞进入凋亡程序。有研究认为,ROS是细胞新陈代谢的产物，在细胞凋亡的发生发展过程中起着重要的作用l24。文献报道,Cecropin A及To-mextosin可通过下调线粒体膜电位和增加细胞内ROS含量诱导HeLa细胞凋亡。本实验研究结果显示，在MAF-1A作用下HepG2细胞线粒体膜电位降低，且高浓度MAF-1A（400my/L）组HepG2细胞内的ROS水平明显升高，表明MAF-1A可以下调HepG2细胞的线粒体膜电位，
并且在一定浓度下可诱导细胞内ROS大量产生，提示下调线粒体膜电位及促进细胞内ROS的产生可能是MAF-1A诱导HepG2细胞凋亡的原因。
通常认为肿瘤细胞的细胞周期包括2个时期，即有丝分裂间期和有丝分裂期（M期）o有丝分裂间期又可划分为DNA合成前期（G1期）、DNA 合成期（S期）和DNA合成后期（G2期），细胞还未进入分裂期时，处于静止的状态称G0期[47]o研究发现，当肿瘤细胞周期中的任何一个时期受到阻滞，可以导致肿瘤细胞增殖受阻[8。实验研究报道，来源于蜘蛛的毒液肽可通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡，从而抑制HeLa细胞的生长。本研究的细胞周期检测结果显示，不同浓度的MAF-1A 均能使HepG2的G2/GI期细胞所占比例升高（P <0.01），表明MAF-1A可将细胞周期阻滞于G0/ G1期。
综上所述，本研究认为MAF1A可能通过促进线粒体膜电位下调、增加细胞内ROS含量所介导的细胞凋亡，以及阻滞细胞周期来发挥抑制HepG2细胞的作用。
4参考文献
[1]NILSSON B O.What can wc leara adopt funchouai impoe-
135

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