抗生素引起细菌体内氧胁迫及其应激响应机制
张翎，余志良，裘娟萍*
（浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州310014）
摘要：抗生素可诱导细菌产生活性氧（ROS ）而造成氧化损伤，ROS 的积累可以增强抗生素的杀菌效
果。因此，抗生素作用下细菌死亡机制除抗生素作用特异性靶点而产生的选择性毒力外，还包括ROS 氧化损伤产生的非选择性毒力。细菌通过自身抗氧化系统（OxyR 、SoxRS 及PerR ）的调控机制促进ROS 清除、修复氧化损伤以响应抗生素引起的ROS 增加。本文对抗生素作用下胞内ROS 的产生机制和细菌对氧化损伤的响应机制进行综述。
关键词：抗生素；活性氧（ROS ）；应激响应；抗氧化系统中图分类号：Q939.92
文献标识码：A
文章编号：1001-7119（2017）03-0062-09
DOI:10.13774/jki.kjtb.2017.03.012
Antibiotics-induced Bacterial Oxidative Stress and Bacterial Response
Zhang Ling ，Yu Zhiliang ，Qiu Juanping *
（College of Biological Engineering ，Zhejiang University of Technology ，Hangzhou 310014，China ）Abstract ：Antibiotics can induce a cascade of reactive oxygen species (ROS)in bacteria.The perturbations due to induced ROS accumulation affect the lethal activity of diverse antibiotics.It is believed that antibiotics-induced ROS also involves in the antibiotic lethal activity to bacteria with the
exception of primary drug-target damage.Bacteria utilize antioxidant system (OxyR 、SoxRS and PerR)to regulate ROS scavenging and oxidative stress repair in response to increase of ROS induced by antibiotics.This paper reviews the mechanisms of ROS generation and bacterial response to oxidative stress in the existence of antibiotics.
Keywords ：antibiotics ；ROS ；response ；antioxidant system
收稿日期：2016-04-20基金项目：长三角绿制药协同创新中心协同科研项目。作者简介：张翎（1990-），女，硕士研究生，专业方向：应用微生物学。E-mail:zlpkxx@126 。*通讯作者：裘娟萍（1958-），女，教授，从事应用微生物研究。E-mail:qiujping@zjut.edu 。
杀菌类抗生素能够有效杀灭致病菌，从而快
速治愈疾病，与抑菌类抗生素相比，更有利于抑制多耐药菌的产生。杀菌类抗生素的杀菌机制已被广泛研究，主要通过作用于专一性的细胞靶位点来破坏细胞的特定部位，最终引发微生物的死亡。然而，最近有研究发现一些杀菌类抗生素除了专一性作用靶点外，拥有共同的新型杀菌机制：杀菌过程中均出现活性氧（ROS ，reactive oxy⁃gen species ）的产生或积累。
ROS 通常包括三种：过氧化物（O 2-）、过氧化
氢（H 2O 2）和羟基自由基（HO ·）。ROS 能引起细胞
大分子的氧化，如：蛋白质羰基化、脂质过氧化和DNA 的损伤，如果ROS 的积累不受控制，这些氧化过程会杀死细胞。
细菌虽然具有调控系统（OxyR 、PerR 、SoxR ）和清除系统（SodA 、SodB 、SodC 、AhpCF 、KatG 、KatE ）以及修复系统（SOS 等）。但当胞内ROS 产生过多或系统故障时，细菌会发生损伤。
本文就抗生素引起细菌ROS 产生及细菌对此的响应机制进行综述。
第33卷第3期2017年3月
科技通报
BULLETIN OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
Vol.33No.3Mar.2017
第3期
1抗生素作用促进菌体内ROS增加1.1抗生素作用下细菌体内ROS产生的发现
众多研究者发现，抗生素导致胞内ROS上升，机体氧化损伤明显增加，见表1。Collins等发现在诺氟沙星、氨苄青霉素和卡那霉素三种杀菌抗生素的作用下，大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus）细胞内HO·激增，添加硫脲（ROS清除剂）和联吡啶（铁离子螯合剂，Fenton反应抑制剂）后，HO·的积累和细胞死亡均有降低[1]；过氧化氢酶和过氧化物酶的缺失可以增强上述三种杀菌抗生素的致死作用[2]；Karl Drlica和Lewin CS发现喹诺酮的杀菌作用在无氧条件下被阻断[3,4]，可见抗生素作用下细菌的死亡受到ROS积累的影响（表2）。
表1抗生素作用下ROS产生
Table1Cell death from antibiotics with the involvement of ROS
1.2ROS产生的机制
一般认为ROS伴随细胞的呼吸作用而产生。分子O2通过氧化呼吸链中重要的电子载体——酶的金属中心、黄素、呼吸醌等辅基，可产生O2-和H2O2[15]。
黄素蛋白的自氧化被认为是O2-和H2O2的主要来源[16,17]。当O2与黄素蛋白的辅基FADH2发生碰撞时，黄素蛋白发生自氧化，其间电子转移产生了O2-和黄素半醌自由基。有时O2-立即扩散，但是大多数情况下在O2-离开活性位点后第二个电子才转移形成可溶解的H2O2自由基。因此，黄素蛋白可促使O2-和H2O2产生。黄素蛋白自氧化速率与其碰撞O2的频率有关[18]。当黄素蛋白辅基在O2中暴露程度大时，即黄素蛋白自氧化的程度高时，ROS损伤会相应增加。例如，琥珀酸脱氢酶是细胞主要的厌氧呼吸酶，通常与O2发生快速反应。在厌氧环境下，兼性或厌氧菌中O2-主要来源于以黄素为辅基的琥珀酸脱氢酶的氧化[17,19]。当O2的浓度高时，ROS形成更多[16]。这也是O2浓度过高时对细胞产生毒性的原因。在E. coli中，甲基萘醌是呼吸链中氧化还原电势较低的电子载体，其自氧化可形成ROS[20]，其自氧化速率也与O2的浓度有关（图1）。
超氧化物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）氧化O2-产生H2O2。H2O2参与芬顿反应（Fenton re⁃action）或哈伯·韦斯反应（Haber-Weiss）产生毒性更强的HO·（图2）。
1.3抗生素促进ROS产生
抗生素通过作用三羧酸循环（TCA，tricarbox⁃ylic acid cycle），可引发电子传递链呼吸作用增
抗生素
种类
喹诺酮类
β-内酰胺类氨基糖苷类糖肽类多粘菌素类
名称
萘啶酸
恶喹酸
诺氟沙星
环丙沙星
莫西沙星
PD161144
氨苄西林
卡那霉素
庆大霉素
万古霉素
多粘菌素B
多粘菌素E
ROS
增加
是
是
是
是
是
是
是
是
是
是
是
是
种类
全部
HO·
全部
全部
HO·
HO·
全部
全部
HO·
HO·
HO·
检测方法
H2DCFHDA
HPF
HPF等
光泽精和普
鲁诺
HPF
HPF
Oxyburst
Green等
DAF-FM等
HPF
HPF
HPF
参考
文献
[3]
[5]
[1,2,6,
7]
[3,4,8,
9,10]
[5,11]
[3,5]
[1,2]
[6,12]
[1]
[13]
[13]
表2三种方法干扰ROS产生对抗生素杀菌效果的影响
Table2Effect of three methods of ROS perturbation on
antibiotic lethality
抗生素
种类
喹诺酮类
β-内酰胺类
氨基糖苷类
多粘菌素类
名称
萘啶酸
恶喹酸
诺氟沙星
环丙沙星
氧氟沙星
莫西沙星
PD161144
氨苄西林
苯唑西林
头孢呋锌
卡那霉素
庆大霉素
多粘菌素
B
多粘菌素
E
三种干扰方法
厌氧条
件
阻断
阻断
降低
降低或
阻断
阻断
降低
无影响
降低
——
——
延迟或
降低
降低
——
——
ROS抑
制剂
阻断
阻断
降低
降低
——
降低
无影响
降低
降低
降低
降低
降低
降低
降低
缺失ROS清
除酶
△katG增加
△katG增加
△katG增加
katG过表达
降低
△katG增加
——
—
—
——
△ahpCF增加
——
——
△ahpCF增加
katG过表达
降低
——
——
参考
reactive oxygen species (ros)
文献
[3]
[5]
[1,2,
6,7]
[3,4,8,
9,10]
[4]
[5,11]
[3,5]
[1,2]
[11]
[14]
[1,2]
[6,12]
[13]
[13]
张翎等.抗生素引起细菌体内氧胁迫及其应激响应机制63
第33卷
科技通报强，减少胞内NADH 含量，最终引发E.coli 细胞内ROS 增加[1,21]。用氨基糖苷类抗生素处理E.coli 时，随之NADH 大量减少，Fe-S 簇破坏产生大量HO·[22]。Collins 等研究表明，杀菌类抗生素作用E.coli 可使菌体耗氧速率增加，这可能加速呼吸作用，从而引发ROS 产生增加[23]。
2ROS 对细胞的损伤作用
2.1
ROS 破坏氨基酸合成
早期研究没有发现自由基可破坏生物大分子，所以O 2-是否对细胞产生毒性作用并无明确的结论[24]。直到1976年研究者才发现O 2-可损伤细胞：Brown 在高压氧作用的野生型E.coli 中发现氨基酸营养缺陷型[25]；10年后，Carlioz 报道SOD-缺失突变株表现出相似表型：支链（亮氨酸Leu 、异亮氨酸Ile 、缬氨酸Val ），芳香族（酪氨酸Tyr 、氨酸Try 、苯丙氨酸Phe ），亚硫（甲硫氨酸Met 、半胱
氨酸Cys ）氨基酸缺陷[26]。这些结果表明高氧条件
可能会加速O 2-的形成，并且O 2-能够专一破坏这些氨基酸的合成途径。近年James A.Imlay 研究也表明在细胞内缺少过氧化氢酶和过氧化物酶时H 2O 2积累可引起类似结果[27]。
2.2ROS 引起Fe-S 簇脱水酶的失活
Fe-S 簇脱水酶的失活会引发分解代谢和合成代谢的异常[28,29]。Fe-S 簇脱水酶属于Fe-S 蛋白家族，包含[4Fe-4S]2+型Fe-S 簇，[4Fe-4S]2+结合α，β二羟酸底物，直接参与脱水反应。O 2-和H 2O 2均可进入酶的活性位点，结合关键的Fe 2+。O 2-攻击Fe-S 簇，将Fe-S 簇氧化为[4Fe-4S]3+，自身转变为H 2O 2，由于[4Fe-4S]3+极不稳定，随着释放出Fe 2+，形成[3Fe-4S]+，Fe-S 簇遭到破坏，酶失活。H 2O 2与O 2-相似，能够直接结合并氧化脱水酶[4Fe-4S]2+簇的Fe 2+，使其转变为[3Fe-4S]+，形成Fe 3+沉淀、酶失活。
2.3ROS 引起的DNA 损伤
在一般情况下，ROS 对DNA 的氧化损伤主要是引起基因突变。虽然H 2O 2和O 2-都不能直接损伤DNA ，但作用超氧化物岐化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶突变株均有较高的突变率[30,31]，H 2O 2通过与细胞内游离Fe 2+发生Fenton 反应产生HO·[32]，由于HO ·是极强的氧化剂，几乎可与所有有机分子发生反应、损害活性位点残基。HO ·氧化DNA 的碱基和核糖，从而引发多种损伤[33,34]。例：氧化鸟嘌呤产生的8-羟基鸟嘌呤是一种常见的氧化产物，它能够避开DNA 聚合酶对内部错配的检测，从而导致DNA 损伤引发突变[35]。胸腺嘧啶的氧化，可以阻碍DNA 聚合酶的延伸、使DNA 复制终止从而引发大规模DNA 损伤[36]。脱氧核糖的氧化使单链DNA 的5'端羟基化，阻断DNA 聚合酶复制[37]。
3细菌对ROS 产生的响应
3.1合成ROS 的清除酶类3.1.1清除O 2-的酶
O 2-自发的歧化作用不能降低细胞内O 2-浓度，一般的革兰氏阴性菌以合成SOD 来降解O 2-。E.coli 包含三种SOD 酶：细胞质Fe-SOD 、Mn-SOD 及周质Cu-Zn SOD 。在周质空间中，Cu-Zn SOD 只在稳定期时合成[38]，而周质O 2-在对数期
左途径：电子通过黄素半醌或O 2-自旋反转被吸收，H 2O 2被释放；右途径：连续释放两个O 2-
图1黄素蛋白辅基FADH 2自氧化的两种途径
Fig.1Two pathways of adventitious FADH 2oxidation on
flavoproteins
a 和
b ：Fenton 反应；
c ：Haber-Weiss 反应
图2HO ·的产生途径
Fig.2Two reaction of HO·generation
64
第3期
形成[20]，故周质SOD的合成非O2-诱导。
细胞质SOD的活性较高，控制O2-在nM以下[39]。同工酶Fe-SOD和Mn-SOD均受Fe2+水平的调控。当Fe2+浓度较高时，铁吸收调控蛋白（Fur，ferric uptake regulator）阻断Mn-SOD的合成，此时Fe-SOD合成；当Fe2+浓度低时，去活化的
Fur刺激编码Fe-SOD的mRNA的降解，使Fe-SOD合成受阻，同时Fur诱导合成锰输入蛋白（MntH，manganese/divalent cation transporter），从而活化并刺激Mn-SOD合成[40-42]。Mn-SOD的合成也受抗生素存在下O2-的刺激[43,44]。
3.1.2清除H2O2的酶类
细菌具有多种H2O2分解酶，对H2O2清除十分复杂。例如，一般生长条件下，E.coli有3种酶发挥清除H2O2的作用[45]。烷基过氧化物还原酶Ah⁃pCF（Ahp，alkyl hydroperoxide reductase）是最主要的清
除酶，它可以将NADH上的电子转移到H2O2，从而将H2O2还原为水。过氧化氢酶（KatG，catalase G）属于过氧化氢酶-过氧化物酶家族，只在对数期细胞有微弱表达。当细胞处在外部H2O2高胁迫下，H2O2响应调控子OxyR强烈诱导AhpCF和KatG合成[46]。过氧化氢酶（KatE，cata⁃lase E）受RNA聚合酶sigma S因子（RpoS，RNA polymerase sigma S factor）系统诱导，只在稳定期强烈表达[47]。在低水平的H2O2下，Ahp能有效降低H2O2浓度。当细胞内H2O2超过20μM时，过氧化氢酶比Ahp更有效地清除H2O2。
3.2激活ROS的应激调控系统
3.2.1H2O2的调控系统
环境中存在不同的H2O2来源。H2O2是小分子物质、不带电，可以透过细胞膜。在富含H2O2环境中的细菌更有可能发生氧化损伤，细胞通过OxyR或H2O2调控抑制子（PerR，peroxide regulon repressor）系统应激响应。
在E.coli中，细胞依赖OxyR响应H2O2压力。在正常的好氧条件下生长，细胞内H2O2浓度在50nM左右，此时OxyR处于失活状态。当E.coli 细胞外H2O2的浓度超过200nM时，H2O2内流速率会超过细胞内自身合成H2O2的速率[48]。当细胞内H2O2浓度超过200nM时，OxyR的Cys残基能与H2O2快速发生反应[49,50]，使其形成二硫键，从而激活OxyR，活化的OxyR促进一系列染体上与抗氧化有关基因的
转录。OxyR可诱导合成超过正常值10倍的KatG和Ahp，导致H2O2浓度下降，确保胞内H2O2维持在一定浓度范围内不足以对细胞产生损伤作用。
革兰氏阳性菌回应H2O2胁迫的机制与E.coli 不同，受OxyR调控激活的抗氧化基因由PerR负调控，在某些细菌中PerR可与OxyR共存。在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中，由金属离子Fe2+或Mn2+激活的PerR结合DNA可抑制与氧化损伤响应相关基因的（katA，ahpC，mrgA）转录表达及PerR自身的合成[51-53]。当细菌处于H2O2浓度低于8μM环境中或Fe2+、Mn2+缺乏时，PerR失活，不能与DNA结合，大多数受其调控的基因不受阻遏，处于活化的状态，从而诱导ROS响应相关基因的表达[53,54]。
3.2.2O2-的调控系统
在生理pH环境下O2-带1个电荷，它不能透过细胞膜[55,56]。这说明细胞质O2-是在细胞内形成的。拮抗菌可通过分泌氧化还原剂（吩嗪或醌）来诱导靶细菌产生O2-而杀菌。吩嗪等氧化还原剂进入靶细胞内[57,58]，从低电势物质（呼吸醌和黄素）获得电子并转移给O2，从而形成O2-。当用吩嗪和白花丹素等氧化还原剂处理E.coli时，O2-的形成速率会增加100倍[59]。
过氧化物响应调控子SoxR是同型二聚体调控蛋白，每个亚基含有一个感应簇[2Fe-2S]+。胞内过氧化物调控系统SoxRS在正常条件下不被激活，当暴露于氧化还原剂时，亚基中的感应簇被氧化，氧化态的SoxR能结合soxS基因上游区域，刺激转录表达SoxS蛋白。SoxS蛋白作为次级转录因子可促进附近基因
sodA的表达[60]，合成Mn-SOD。早期研究表明氧化还原剂作用下Mn-SOD 的浓度增加超过10倍[61]。当氧化还原剂被去除时SoxR恢复到还原态[58]。还原态的SoxR不能刺激soxS基因的转录表达，SoxS蛋白被Clp蛋白酶系统（caseinolytic protease）降解，由此响应结束[62]。
SoxRS也可调控其他一些功能蛋白，如脂多糖核心合成蛋白（WaaZY，lipopolysaccharide core biosynthesis protein）等[63]。这些蛋白通过修饰细胞膜的电荷和孔蛋白、刺激氧化还原剂排出细胞以及化学修饰氧化还原剂等途径来减慢氧化还原剂进入细胞的速度[64-66]。
3.3修复氧化损伤的系统
张翎等.抗生素引起细菌体内氧胁迫及其应激响应机制65
第33卷科技通报
3.3.1DNA氧化损伤的修复
DNA氧化损伤发生后，负责修复的酶有：甲酰氨基嘧啶-DNA糖基化酶（Fpg，formamidopyr⁃imidine-DNA glycosylase）、核酸内切酶Ⅳ（endo⁃nucleaseⅣ）、核酸内切酶Ⅷ（endonucleaseⅧ）、核酸外切酶Ⅲ（exonucleaseⅢ）和核酸外切酶Ⅳ（exonucleaseⅣ）。其中，Fpg、核酸内切酶Ⅳ和核酸内切酶Ⅷ对DNA损伤无高度专一性，当它们扫描到DNA损伤部位时便切除被氧化碱基[67-69]。核酸外切酶Ⅲ
和核酸外切酶Ⅳ则负责切除受损的核糖部分、恢复3’引物使DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ，DNA polymeraseⅠ）继续复制DNA[70]。
一旦切除系统不能识别损伤部位或者复制叉遇到未修复的DNA加合物，细胞开始启动复制后重组修复系统。重组基因（rec）缺失的突变株对外源H2O2极其敏感，在有氧条件下△recA菌株因不能合成过氧化氢酶/过氧化物酶或SOD酶而产生致死效应[71]。重组修复基因和切除修复都缺乏的菌株：如△recA xth突变株（缺失DNA重组修复蛋白RecA和外切酶Ⅲ）和△polA recB突变株（缺失PolⅠ和核酸外切酶Ⅴ的RecB亚基），只有在无氧条件下才能存活[72,73]。
当切除修复和重组修复不起作用时会产生大量突变，RecA调控SOS系统的表达，激发SOS 修复，SOS系统是DNA损伤修复最终的选择。SOS系统调控DNA聚合酶Ⅳ（PolⅣ，DNA poly⁃meraseⅣ）和DNA聚合酶Ⅴ（PolⅤ，DNA poly⁃meraseⅤ）的表达，这些跨损伤聚合酶使DNA可以越过损伤部位继续复制。RecA也调控sfiA（也称sulA），它编码使细胞分裂延迟的蛋白，能够使细胞在复制恢复、妹染体形成后再分裂。
DNA修复不受OxyR控制，但核酸内切酶Ⅳ的编码基因nfo受SoxRS调控的，因为soxR可编码一些诱导nfo的物质[44]。当E.coli处于高H2O2浓度时，由于酶的失活可引发生长停滞和代谢减缓；在H2O2被足够的过氧化物酶和过氧化氢酶清除后，细胞代谢得以恢复，此时SOS系统被激活，修复蛋白合成、DNA损伤才被修复。
3.3.2蛋白质氧化损伤的修复
ROS对蛋白质氧化损伤最主要的是Cys巯基氧化形成二硫键，使蛋白质结构发生改变而失活。细胞内存在硫氧还蛋白（thioredoxins）和谷氧还蛋白（glutaredoxins）、蛋氨酸亚砜还原酶（methi⁃onine sulfoxide reductase）、砷酸还原酶（arsenate reductase）、周质二硫键还原酶（Dsb，disulfide bondforming protein）等用于还原H2O2作用下氧化形成的二硫键。在E.coli中，谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase）、谷氧还蛋白1（glutaredox⁃in1）和硫氧还蛋白2（thioredoxin2）在OxyR调节子的激活下合成[74]。但在芽孢杆菌属（Bacillus）、分支杆菌属（Mycobacteria）、红杆菌属（Rhodo⁃bacter）和链霉菌属（Streptomyces）中谷氧还蛋白或硫氧化蛋白合成不受OxyR调节子调控[75-77]。在Streptomyces中氧化反应产生的二硫键可以激活anti-sigma因子，从而诱导硫氧还蛋白的合成[78]。
ROS也可损伤蛋氨酸残基，使其氧化为蛋氨酸亚砜（MetSO），导致蛋白质结构改变或失活。蛋氨酸亚砜还原酶MsrA/MsrB构成的修复系统负责修复该损伤[79]。氧化产生的MetSO，根据侧链硫原子的不对称位置，分为Met-(S)-SO和Met-(R)-SO。蛋氨酸亚砜还原酶MsrA和MsrB可分别将MetSO的S和R异构体形式还原为Met，电子一般由硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶系统提供。首先MsrA/MsrB作用于被氧化的Met残基部位，产生一个次磺酸中间体并释放被修复的蛋氨酸；然后氧化态MsrA/MsrB被硫氧还蛋白还原。用H2O2作用E.coli、酵母菌（yeast）和欧文氏菌（Er⁃winia），发现其msrA基因突变株对H2O2更
加敏感[80-82]。
4抗生素作用下ROS引起细胞死亡的途径及其调控
细菌在一定浓度的抗生素作用下，产生初级靶标损伤，如蛋白质或RNA合成抑制等（图3a）。初级损伤可激活毒素-抗毒素（TA，toxins-antitox⁃ins system）系统，TA系统中MazEF发生降解并释放MazF毒素和抗毒素MazE（图3b）。不稳定的MazE可被Clp蛋白酶降解，使MazF水平相对增加。细胞内MazF游离存在的时间和数量有一个阈值，当MazF水平低于该阈值时，MazE形成特殊构象，能识别MazF并与MazF相互作用形成MazF2-MazE2-MazF2六聚体，MazF毒性作用被抑制[83]；当MazF水平超过该阈值时，MazF对细胞的毒性作用不能被MazE抑制，导致细胞死亡[84]。
66

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