ROS清除剂在细菌抗生素耐受中的作用研究进展
reactive oxygen species (ros)李梦婷; 曾洁; 刘小东; 薛云新; 王岱
【期刊名称】《《中国抗生素杂志》》
【年(卷),期】2019(044)010
【总页数】8页(P1132-1139)
【关键词】ROS清除剂; 细菌; 耐受; 抗生素; 作用
【作 者】李梦婷; 曾洁; 刘小东; 薛云新; 王岱
【作者单位】分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室 厦门大学 厦门361102
【正文语种】中 文
【中图分类】R915
自从1928年发现青霉素以来，大量抗生素被投入使用，由于早期人们对抗生素的了解较少，导致抗生素在很长一段时间内不合理使用，产生了很多危害，甚至出现了“超级细菌”[1]。常见的杀菌抗生素可以分为3大类，β-内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类，这些杀菌抗生素在杀菌时存在一条共有的依赖于ROS的杀菌通路(图1)，即他们与各自相应的初级靶位点结合后，通过依赖于TCA循环的电子传递链产生超氧化物，超氧化物会损坏铁硫簇释放Fe2+，使Fe2+被Fenton反应氧化，Fenton反应导致羟基自由基的形成，并对DNA、脂质和蛋白质产生破坏，导致细胞的死亡[2]。在这一过程中，由于细胞中氧化剂的产生和自身抗氧化应激能力不足以清除过量的ROS，过量的ROS对细菌产生毒性造成细菌死亡，这在抗生素杀菌过程中起着重要的作用[2-3]。
图1 抗生素诱导杀菌的机制Fig.1 The common mechanism of which antibiotics kill bacteria
活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)是细胞在有氧条件下进行能量代谢产生的一类具有氧化活性的分子总称，包括羟自由基(·OH)、超氧阴离子(O2·-)和过氧化氢(H2O2)等，它们在细菌的生理和病理发展中都起着十分重要的作用[4-5]。在真核生物中，细胞在正常生理代谢过程中形成的ROS被认为是参与细胞生长、分化和死亡的重要信号介质[4]，真核细胞中也
存在自身的抗氧化机制来平衡过量的ROS，以便细胞能在适宜的环境中进行生长代谢。在细菌中，ROS也能够损伤核酸、蛋白质和脂质，当胞内ROS水平超过机体解毒作用和修复能力水平时导致细胞死亡[6]。过量的ROS不仅可以将细菌杀死，也能使细菌的某些基因发生突变，这也被认为是细菌通过自发突变获得抗生素耐受和耐药性的方法之一。细菌对抗生素的耐受性是指细菌对抗生素的MIC不变，但其在抗生素存在时有较高存活率的一种状态，在抗生素时，耐受细菌和耐药细菌有着相同的生存优势，同时，在一定条件下，耐受细菌也较易发展为耐药细菌，因此消除细菌耐受和耐药问题也是在抗生素使用过程中噬待解决的问题[1,7]。虽然细菌可以通过转录调控的方式上调参与氧化应激的蛋白KatG(hydroperoxidase I)、KatE(catalase II)、SoxS(DNA-binding transcriptional dual regulator SoxS)、OxyR(DNA-binding transcriptional dual regulator OxyR)和AhpCF(alkyl hydroperoxide reductase)等中和过量的ROS[8-12]，但是在抗生素作用下产生的大量ROS已经超过细菌自身的解毒能力，因此通过使用外源ROS清除剂中和细胞内过量的ROS能够减少抗生素刺激产生的过量ROS对细菌遗传物质的损伤，从而增加细菌发生耐受和耐药突变的频率，也已经成为研究细菌发生耐受和耐药突变机制的一种常用方法[13-14]。
许多细菌感染复发与用抗生素细菌感染失败都和细菌对抗生素耐受有关。对抗生素耐受
性(tolerance)通常是指细菌在远高于最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)剂量的杀菌抗菌剂作用下能短暂存活的能力[15]。目前最新界定细菌耐受的标准是细菌对抗生素具有较低的MIC，但有较高的杀死99%细菌所需的最短时间(minimum duration of treatment that is required to kill 99% of a bacterial population,MDK99)相对于非耐受菌株[16]。先前的研究报道在使用氟喹诺酮类抗生素奥索利酸和环丙沙星进行MIC测定和杀菌曲线测定实验中添加ROS清除剂二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)时并没有改变细菌对这两种抗生素的MIC但是增加了细菌对这两种抗生素的MDK99相对于没有添加ROS清除剂的对照组[17-18]，说明在细菌对抗生素的杀菌动力学测定实验中添加ROS清除剂能够增加细菌对抗生素的耐受性，但是目前并没有文献将ROS清除剂对细菌耐受性进行综述。本文主要通过对常见的外源ROS清除剂过氧化氢酶、硫脲、联吡啶、二甲基亚砜、褪黑素在应用方面的研究进行了总结，并对不同的ROS清除剂对细菌耐受性的影响进行了分析，以期待能更好的了解外源ROS清除剂的更为宽广的应用范围和作用机制，从而对研究细菌药物耐受及耐药机制给予理论指导。
1 过氧化氢酶
过氧化氢酶(catalase,CAT)是一种比较常见的ROS清除剂(表1)，于1811年被泰纳尔首次发现，其主要功能是将过氧化氢分解为O2和H2O，避免机体受到H2O2的损伤。常见的过氧化氢酶主要有3类：单功能过氧化氢酶、双功能过氧化氢酶、非血红素(锰)和小过氧化氢酶[19]。在有氧化应激的细胞中，过氧化氢酶的存在能够降解过多的H2O2，从而抑制Fenton反应，减少细胞的死亡[21]。
表1 常见的ROS清除剂Tab.1 Common ROS scavengers增加耐受性 细菌自主合成 参考文献过氧化氢酶 H2O2 环丙沙星、利福平等 是 是 [13]硫脲 羟基自由基 氨苄西林、卡那霉素、达托霉素、诺氟沙星、环丙沙星、利福平、等ROS清除剂 清除类型 抗生素是否 [14,18,32,33,70]联吡啶 螯合亚铁离子，降低Fenton反应达托霉素、莫西沙星、奥索利酸、诺氟沙星、黏菌素等是否 [18,37,38,42,70]DMSO 羟基自由基 氨苄西林、卡那霉素、环丙沙星、奥索利酸等 是 否 [17]褪黑素 羟基自由基 环丙沙星等 有待确定 是 [52,71]白藜芦醇 羟基自由基 环丙沙星、卡那霉素、达托霉素等 是 否 [57,62]谷胱甘肽 H2O2，羟基自由基 氟喹诺酮类抗生素等 是 否 [66,68]
在细菌中过氧化氢酶的灭活或缺失能增强抗生素的杀菌能力，而过氧化氢酶的表达能减少细
菌胞内H2O2的浓度，提高细菌对抗生素的耐受性，从而减少抗生素对细菌的杀伤作用。特别在研究ROS引起的氧化应激和抗菌性抗生素介导的ROS杀菌等问题上，过氧化氢酶发挥着重要的作用[13]。如通过青蒿琥酯灭活过的过氧化氢酶或敲除相关的过氧化氢酶合成基因可以增加抗生素的杀菌能力[22]；在铜绿假单胞菌中通过严谨反应调节过氧化氢酶可以保护铜绿假单胞菌免受H2O2和抗生素介导的杀伤作用[23]；在呼吸道相关的机会致病菌和嗜水气单胞菌等的存活中，过氧化氢酶也起着重要的调控作用[24-25]。
在植物和动物等中，过氧化氢酶活性也起着十分重要的作用。在植物中，病原菌诱导的氧化还原核仁毒素Ⅰ(NRXⅠ)可以通过保护过氧化氢酶等，提高过氧化氢酶的解毒能力，从而保护细胞免受氧化应激的损伤[26]；在水稻细菌性枯叶病中，由黄单胞菌和米曲霉编码的CAT有助于细菌免受PCA(吩嗪-1-羧酸)诱导的压力[27]。在动物中，过氧化氢酶参与了体内的多种生理反应，如过氧化氢酶通过调节ROS的水平来参与宿主肠道与微生物的体内平衡[28]；肿瘤细胞中的肿瘤因子P53和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCC)的抗癌功能也被认为可能是通过保持过氧化氢酶的活性来抑制ROS的积累，以此保护正常细胞免受内源性ROS的损伤[29-30]。在环境保护方面，污染环境中的过氧化氢酶可能在对活性氧的抗性及降解特定污染物等方面发挥着巨大的作用[31]。但CAT是一种酶，它在使用时对周围环境较为敏感，比较
容易失活。
2 硫脲
硫脲(又称硫代尿素，thiourea)(表1)，是一种化工产品，常用于工业方面，如染料、树脂等的原料，因其能与氧化剂发生强烈的化学反应，在细菌和植物中也是一种良好的羟基自由基清除剂。
硫脲常用于研究抗生素杀菌，是由于过量的ROS产生的氧化毒性能导致细菌死亡，而非抑制浓度的硫脲的添加，能减少细菌胞内羟基自由基的浓度，增加细菌对抗生素等引起ROS增多物质的耐受性，从而提高细菌的存活率。Grantss等[32]发现在耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌的持留菌中维持有较高的溶解氧，当抗生素处理时，细菌会发生死亡，而在其中加入硫脲后，细菌的存活率会大大的增加；在大肠埃希菌中，添加亚抑制浓度的硫脲会减少细菌内羟基自由基的积累，使细菌不被氨苄西林、卡那霉素和环丙沙星3种杀菌性抗生素的杀死[18]；在亚致死浓度的抗生素处理的细菌中，会诱导细菌基因组发生突变，导致细菌耐药性的增加[33]，而加入硫脲能明显减少抗生素诱导产生的耐药突变[14]。精油中的主要成分含氧单萜柠檬醛和香芹酚是一种抗微生物剂，为研究其与常见的杀菌性抗生素的机制的异同，会添加硫
脲作为ROS清除剂，来探究其机制是否与ROS有关[34]。在研究大肠埃希菌对脂肪酸的利用的实验中，添加硫脲能显著降低胞内的H2O2的浓度，减少H2O2对大肠埃希菌生长的抑制，促进了脂肪酸转变为L-赖氨酸，也为工业上L-赖氨酸的生产提供了很好的指导意义[35]。在农业上，硫脲的使用也较为广泛，在农作物的叶片上施用硫脲不仅可以增强田间条件下不同作物的胁迫耐受性，也能增加农作物的产量和含油量[36]。但硫脲在使用时会对环境和人造成较大的伤害，且容易致癌，使用过程中需做好防护措施。
3 联吡啶
联吡啶(bipyridine,DIP)主要有2,2'-联吡啶和4,4'联吡啶(表1)，是由三氯化铁与吡啶反应而得到的，主要用于有机合成，是医药中间体，本文主要阐述的是2,2'-联吡啶的功能和用途。
2,2'-联吡啶也是金属离子螯合剂，在ROS的相关实验上，添加在细菌中时能很好地鳌合Fe2+，降低Fenton反应的发生，减少ROS的产生，增加了细菌对相关物质的耐受性，增强了其存活率。如在大肠埃希菌中，添加亚抑制浓度的的硫脲和2,2'-联吡啶能够显著减少奥索利酸或诺氟沙星处理时细菌胞内的羟基自由基的浓度，增强了大肠埃希菌对这两种抗生素的耐受性，减少了对大肠埃希菌的杀死[37]；在其他探究铁离子作用的相关抗生素和ROS实验
方面，2-2'-联吡啶也发挥了重要作用，在含有鲍曼不动杆菌的培养基中，加入2-2'-联吡啶来鳌合环境中的铁，会使得其较易获得多黏菌素抗性[38]；使用2-2'-联吡啶预处理细胞也可以保护原核细胞和真核细胞免受金属离子介导的过氧化氢分解引起的氧化作用对细胞造成的损伤[39-40]。同时在蜡状芽胞杆菌的生物膜的研究中，使用2-2'-联吡啶来降低环境中的铁，当环境中游离的铁被清除时，蜡状芽胞杆菌的生物膜形成会明显减少[41]；在研究无胸腺嘧啶死亡(TLD)的机制过程中，为探究ROS与细菌内TLD的关系时，添加无机化合物2-2'-联吡啶作为ROS清除剂，显著减少了细胞的死亡，探究结果也显示ROS促进了细菌内的TLD[42]。
2,2'-联吡啶也通常存在于许多生物活性天然产物的活性中心，在其中发挥着十分关键的作用。几种常见的从蓝链霉菌或链霉菌属等中分离出来的天然化合物，如caerulomycins、SF2738、collismycins和pyrisulfoxins等[43]，它们具有抗炎、抗菌或抗细胞毒性的作用。例如，caerulomycins A和caerulomycins C显示出抗生素活性[44]；collismycins C具有较强的抗生物膜功能和较弱的抗生素活性和细胞毒性[43-45]；pyrisulfoxins A对小鼠白血病细胞有毒性[46]。但2,2'-联吡啶的大量使用也会造成人的损伤和环境的污染，这是限制其使用的一个重要因素。

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