分泌型丛生蛋白通过抑制线粒体自噬缓解H2O2诱导的
心肌细胞损伤
贺静1，孙晓慧1△，杨莉1，乌宇亮2
摘要：目的探讨分泌型丛生蛋白（sCLU）对心肌细胞氧化损伤的影响及其机制。方法采用大鼠心肌细胞H9C2。实验1分为Control组（仅更换培养基）和H2O2组（100μmol/L H2O2处理）。实验2分为Control组、pcDNA3.1组（转染pcDNA3.1对照空质粒）、pcDNA3.1-sCLU组（转染pcDNA3.1-sCLU过表达质粒）、H2O2组（100μmol/L H2O2处理）、H2O2+pcDNA3.1组（pcDNA3.1对照空质粒转染48h后加入100μmol/L H2O2处理）、H2O2+pcDNA3.1-sCLU组（pcDNA3.1-sCLU过表达质粒转染48h后加入100μmol/L H2O2处理）。实验3分为DMSO组（加入1%体积分数的DMSO）、Mdivi-1组（10μmol/L的Mdivi-1处理）、H2O2+DMSO组（加入1%体积分数的DMSO处理30min后加入100μmol/L的H2O2处理）、H2O2+Mdivi-1组（10μmol/L的Mdivi-1处理30min后加入100μmol/L的H2O2处理）、H2O2+ pcDNA3.1-sCLU组（pcDNA3.1-sCLU过表达质粒转染48h后加入100μmol/L H2O2处理）、H2O2+pcDNA3.1-sCLU+ Mdivi-1组（pcDNA3.1-sCLU过表达质粒转染48h后加入10μmol/L的Mdivi-1处理30min，再加入100μmol/L H2O2处理）。采用MTT法检测细胞活力，TUNEL法检测细胞凋亡，试剂盒检测细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）水平。DFCH-DA荧光探针测定细胞活性氧（RO
S）水平。实时定量聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验检测细胞中sCLU表达，Western blot法检测CLU、PINK1、Parkin和LC3蛋白表达水平。结果（1）实验1。与Control 组比较，H2O2组细胞中sCLU mRNA、细胞培养上清中sCLU蛋白及细胞中CLU蛋白相对表达水平均降低（P＜0.01）。（2）实验2。与Control组比较，H2O2组细胞活力、SOD水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均降低，细胞凋亡率、ROS水平、MDA 水平、PINK1和Parkin蛋白表达水平均升高（P＜0.05）；与H2O2组比较，H2O2+pcDNA3.1-sCLU组细胞活力、SOD水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均升高，细胞凋亡率、ROS水平、MDA水平、PINK1和Parkin蛋白表达水平均降低（P＜0.05）。（3）实验3。与DMSO组比较，Mdivi-1组细胞活力与细胞凋亡率差异无统计学意义；H2O2+DMSO组细胞活力下降，细胞凋亡率升高（P＜0.05）。与H2O2+DMSO组比较，H2O2+Mdivi-1组、H2O2+pcDNA3.1-sCLU组和H2O2+pcDNA3.1-sCLU+ Mdivi-1组细胞活力均升高，细胞凋亡率均下降（P＜0.05）。与H2O2+Mdivi-1组比较，H2O2+pcDNA3.1-sCLU组和H2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1组细胞活力差异无统计学意义，细胞凋亡率降低（P＜0.05）。结论sCLU对氧化应激条下的心肌细胞具有保护作用，其机制可能与线粒体自噬的抑制有关。
关键词：肌细胞，心脏；氧化性应激；活性氧；丛生蛋白；线粒体自噬
中图分类号：R542.2，R34文献标志码：A DOI：10.11958/20211411
作者单位：1西安宝石花长庆医院心血管内科（邮编710201）；2西安交通大学第一附属医院心血管内科
作者简介：贺静（1980），女，主治医师，主要从事心血管疾病发病机制研究。E-mail：****************
△通信作者E-mail：*******************
37（18）：4432-4434.doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.002.［16］BABU S，KRISHNAN M，RAJAGOPAL P，et al.Beta-sitosterol attenuates insulin resistance in adipose tissue via IRS-1/Akt mediated insulin signaling in high fat diet and sucrose induced type-2diabetic rats［J］.Eur J Pharmacol，2020，873（15）：173004-173016.doi：10.1016/j.ejphar.2020.173004.
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（2021-07-14收稿2021-10-22修回）
（本文编辑陆荣展）
细胞与分子生物学
活性氧（reactive oxygen species，ROS）在氧化应激条件下可在心肌细胞内过量聚集而引起细胞毒性，造成心肌细胞的凋亡和功能失调［1］。丛生蛋白（clusterin，CLU）是一种多功能伴侣蛋白，可分为分泌型和核型。其与氧化还原反应关系密切，是氧化应激反应的感受器，可保护细胞抵抗应激反应。研究显示，CLU可以通过抑制线粒体片段化进而抑制缺血、缺氧条件下的视网膜血管内皮细胞凋亡，从而保护内皮细胞［2］。在心肌梗死患者血清中，分泌型
CLU（secretory clusterin，sCLU）水平显著升高［3-4］。然而，sCLU对心肌细胞氧化应激损伤的作用尚不清楚。本研究拟探讨sCLU对氧化应激条件下心肌细胞损伤的作用及其可能的作用机制，以期为心肌氧化应激损伤的提供新思路。
Secretory clusterin attenuated hydrogen peroxide induced cardiomyocyte injury by
inhibiting mitophagy
HE Jing1,SUN Xiaohui1△,YANG Li1,WU Yuliang2
1Department of Cardiovascular Medicine,Xi'an Baoshihua Changqing Hospital,Xi'an710201,China;2Department of
Cardiology,the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University
△Corresponding Author E-mail:********************
Abstract:Objective To investigate the effects of secretory clusterin(sCLU)on oxidative-induced cardiomyocyte injury and the underlying mechanism.Methods Rat cardiomyocytes H9C2were used in this experiment.Experiment1was divided into the control group(only medium change)and the H2O2group(treated with100μmol/L H2O2).Experiment2was divided into the control group,the pcDNA3.1group(transfected with pcDNA3.1empty plasmids),the pcDNA3.1-sCLU group(transfected with pcDNA3.1-sCLU overexpressed plasmids),the H2O2group and the H2O2+pcDNA3.1group (transfected with pcDNA3.1empty plasmids for48h,and then treated with100μmol/L H2O2).The H2O2+
pcDNA3.1-sCLU was transfected with pcDNA3.1-sCLU over-expressed plasmids for48h,and then100μmol/L H2O2.Experiment3was divided into the DMSO group(adding1%volume of DMSO),the Mdivi-1group(treated with10μmol/L Mdivi-1),the H2O2+DMSO group(treated with1%volume of DMSO for30min,and then added100μmol/L H2O2),the H2O2+Mdivi-1 group(treated with100μmol/L Mdivi-1for30min,and then treated with100μmol/L H2O2),the H2O2+pcDNA3.1-sCLU group and the H2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1group(transfected with pcDNA3.1-sCLU overexpressed plasmids for48h, and then treated with10μmol/L Mdivi-1for30min,and then added100μmol/L H2O2).MTT assay was used to detect cell viability.TUNEL assay was used to detect cell apoptosis.The corresponding Kit was used to detect the activity of reactive oxygen species(ROS),superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA).The expression of sCLU in cells was detected by qRT-PCR and ELISA.The protein expression levels of CLU,mitochondrial autophagy related proteins PINK1, Parkin and LC3were detected by Western blot assay.Results In experiment1,compared with the control group,the relative expression levels of sCLU mRNA,sCLU protein levels in cell culture supernatant and total CLU protein levels in cells were decreased in the H2O2group(P＜0.05).In experiment2,compared with the control group,cell viability,SOD levels and LC3-II/LC3-I ratio were all decreased in the H2O2group(P＜0.05).Apoptosis rate,ROS and MDA levels,PINK1 and Parkin protein expression levels were all increased in the H2O2group(P＜0.05).Compared with H2O2group,cell viability rate,SOD levels and LC
3-Ⅱ/LC3-Ⅰratio were increased in H2O2+pcDNA3.1-sCLU group(P＜0.05).Apoptosis rate,ROS and MDA levels,PINK1and Parkin protein expression levels were all decreased in H2O2+pcDNA3.1-sCLU group(P＜0.05).In experiment3,compared with DMSO group,mdivi-1group showed no significant difference in cell viability and apoptosis rate.Cell viability was decreased and apoptosis rate was increased in H2O2+DMSO group(P＜0.05). Compared with the H2O2+DMSO group,cell viability was increased and cell apoptosis rate was decreased in the H2O2+ Mdivi-1group and H2O2+pcDNA3.1-sCLU group(P＜0.05).There were no significant differences in cell viability and the cell apoptosis rate between the DMSO group and the Mdivi-1group.Compared with the DMSO group,the cell viability decreased and the cell apoptosis rate increased in the H2O2+DMSO group(P＜0.05).Compared with the H2O2+DMSO group,cell viability increased and cell apoptosis rate decreased in the H2O2+Mdivi-1group,the H2O2+PCDNA3.1-sCLU group and the H2O2+PCDNA3.1-SCLU+Mdivi-1group(P＜0.05).There was no significant difference in cell viability between the H2O2+Mdivi-1group,H2O2+pcDNA3.1-sCLU group and the H2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1group(P＞0.05).Conclusion sCLU can protect myocardial cells under oxidative stress,and the mechanism may be related to the inhibition of mitophagy.
Key words:myocytes,cardiac;oxidative stress;reactive oxygen species;clump protein;mitochondrial autophagy
1材料与方法
1.1主要材料与试剂大鼠心肌细胞H9C2购自中科院上海细胞库。DMEM培养基购自美国Gibco公司。胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司。MTT试剂盒、磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）购自武汉博士德生物工程有限公司。H2O2购自国药集团化学试剂有限公司。大鼠sCLU酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。丙
二醛（malonaldehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司。Trizol试剂盒、反转录试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司。实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）购自天根生化科技（北京）有限公司。ECL化学发光试剂盒、RIPA裂解液、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、DCFH-DA 荧光探针、原位末端转移酶标记（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。脂质体Lipofetamine TM2000购自美国Invitrogen公司。线粒体自噬抑制剂Mdivi-1购自美国Sigma公司。sCLU过表达载体pcDNA3.1-sCLU由广州锐博生物科技有限公司合成。兔抗大鼠CLU单克隆抗体、兔抗大鼠磷酸酶及张力蛋白同源物诱导的蛋白激酶1（PTEN induced putative kinase1，PINK1）、小鼠抗大鼠Parkin单克隆抗体、兔抗大鼠微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein1light chain3，LC3）
单克隆抗体、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自英国Abcam公司。
1.2研究方法
1.2.1H9C2细胞的培养及分组采用快速融化法［5］复苏H9C2细胞，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100g/L链霉素的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养。每2~3d传代1次，选取对数生长期的心肌细胞备用。实验分3个部分。（1）实验1。对数生长期的心肌细胞分为Control组（仅更换培养基）和H2O2组（100μmol/L H2O2处理）。（2）实验2。对数生长期的心肌细胞分为Control组（仅更换培养基）、pcDNA3.1组（转染pcDNA3.1对照空质粒）、pcDNA3.1-sCLU组（转染pcDNA3.1-sCLU过表达质粒）、H2O2组（100μmol/L H2O2处理）、H2O2+pcDNA3.1组（pcDNA3.1对照空质粒转染48h后加入100μmol/L H2O2处理）、H2O2+ pcDNA3.1-sCLU组（pcDNA3.1-sCLU过表达质粒转染48h后加入100μmol/L H2O2处理）。（3）实验3。对数生长期的心肌细胞分为DMSO组（加入1%体积分数的DMSO）、Mdivi-1组（10μmol/L的Mdivi-1处理）、H2O2+DMSO组（加入1%体积分数的DMSO处理30min后加入100μmol/L的H2O2处理）、H2O2+Mdivi-1组（10μmol/L的Mdivi-1处理30min后加入100μmol/L的H2O2处理）、H2O2+pcDNA3.1-sCLU组（pcDNA3.1-sCLU过表达质粒转染48h后加入100μmol/L H2O2处理）、H2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1组（pcDNA3.1-sCLU过表达质粒转染48
h后加入10μmol/L的Mdivi-1处理30min，再加入100μmol/L H2O2处理）。
1.2.2qPCR检测细胞中sCLU mRNA表达水平收集1.2.1分组中实验1各组细胞，采用Trizol试剂提取各组细胞总RNA，检测RNA纯度和浓度。采用反转录反应试剂盒合成cDNA。反应总体积20μL：SuperReal PreMix Plus10μL，上、下游引物各0.8μL，cDNA模板2μL，ROX Reference Dye 0.4μL，无RNA酶双蒸水6μL。反应条件：95℃15min；95℃10s，60℃30s，40个循环。sCLU引物：上游5'-TGCCTCTCTCCCACTACGG-3'，下游5'-CTCCTTGCACACT⁃GTCGGG-3'；GAPDH引物：上游5'-GGAGAGTGTTTCCTC⁃GTCCC-3'，下游5'-ACTGTGCCGTTGAATTTGCC-3'。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。
1.2.3ELISA检测培养液上清液中sCLU蛋白含量收集1.2.1分组中实验1各组细胞培养液上清液，采用ELISA试剂盒检测培养上清中sCLU的含量。将100μL的各处理组细胞培养上清液加入酶标板，37℃孵育2h。弃上清液后加入100μL sCLU抗体工作液孵育1h。洗涤3次加入100μL亲和链霉素-HRP孵育30min，TMB显影液显影。在450nm波长处检测样品吸光度（A）值。根据标准品绘制标准曲线并计算样品浓度。
1.2.4Western blot检测细胞中CLU、PINK1、Parkin、LC3蛋白表达收集1.2.1分组中实验1、实验2各组细胞。采用0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗涤3次；加入450μL RIPA蛋白裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋
白。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。各组分别取30μg蛋白上样，SDS-PAGE蛋白电泳；电泳结束后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭，按照常规的方法加入CLU、PINK1、Parkin、LC3、GAPDH抗体（均1∶1000稀释），4℃孵育过夜；TBST缓冲液洗膜3次；加入HRP标记的羊抗兔IgG（1∶5000），室温孵育2h；TBST缓冲液洗涤；采用ECL化学发光试剂盒显。Image J 1.8.0图像分析系统分析灰度值，计算目的蛋白相对表达水平。
1.2.5MTT法检测细胞活力将1.2.1分组中实验2、实验3各组细胞接种于96孔板，每孔200μL，含2×104个细胞，每组设3个复孔。每孔加入MTT溶液（5g/L）10μL，孵育4h，弃上清液，按每孔100μL加入二甲基亚砜（DMSO），震荡10min，酶标仪490nm处读取A值，设对照组细胞活力为100%，计算其余各处理组细胞活力。处理组细胞活力=（处理组A值/对照组A值）´100%。
1.2.6TUNEL试剂盒检测细胞凋亡将1.2.1分组中实验2、实验3各组细胞接种于6孔板中，4%多聚甲醛固定25min，PBS洗涤2次，0.2%的TritonX-100处理5min，漂洗2次，加入50μL TUNEL反应混合液，37℃避光孵育1h。漂洗后加入DAPI染核，抗荧光淬灭封片液封片后，荧光显微镜（×200）下观察（激发波长550nm）各组细胞红荧光阳性细胞所占比例，即为细胞凋亡率。
1.2.7MDA和SOD水平检测将1.2.1分组中实验2各组细胞接种于6孔板中，培养结束后收集各组细胞的上清液，依据试剂盒说明书，检测各组细胞中MDA和SOD水平。
1.2.8DFCH-DA荧光探针测定细胞ROS水平将1.2.1分组
中实验2各组细胞接种于6孔板中，用血清将DCFH-DA 按照1∶1000稀释制备试剂，加入6孔板中，每孔1mL ，37℃培养箱中孵育30min 。吸掉培养液，无血清DMEM 洗涤3次。收集细胞，荧光显微镜（×200）下观察（激发波长488nm ）各组细
胞的荧光强度。ROS 水平以相对于Control 组的相对荧光强度表示。1.3
统计学方法
采用GraphPad 7.0软件进行数据分析。
符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x ±s ）表示，2组间均数比较采用t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey 检验（方差齐）或Dunnett ’s T3法检验（方差不齐）。以P ＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1实验1与Control 组比较，H 2O 2组细胞中sCLU mRNA 、细胞培养上清液中sCLU 蛋白及细胞中CLU 蛋白表达水平均降低（P ＜0.01），见表1、图1。
2.2实验2
2.2.1各组细胞活力和凋亡水平比较与Control 组比较，pcDNA
3.1组和pcDNA3.1-sCLU 组细胞活力及细胞凋亡率差异均无统计学意义，H 2O 2组、H 2O 2+pcDNA3.1组细胞活力降低，细胞凋亡率升高（P ＜0.05），H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU 组细胞凋亡率升高（P ＜0.05），但细胞活力差异无统计学意义。与H 2O 2组比较，H 2O 2+pcDNA3.1组细胞活力及细胞凋亡率差异均无统计学意义，H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU 组细胞活力升高，细胞凋亡率下降（P ＜0.05），见表2、图2。2.2.2各组细胞ROS 、MDA 和SOD 水平的比较与Control 组比较，pcDNA3.1组和pcDNA3.1-sCLU 组细
胞ROS 、MDA 和SOD 水平差异均无统计学意义，
H 2O 2组、H 2O 2+pcDNA3.1组、H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU 组ROS 、MDA 水平均升高，SOD 水平均降低（P ＜0.05）。与H 2O 2组比较，H 2O 2+pcDNA3.1组细胞ROS 、MDA 和SOD 水平差异均无统计学意义，H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU 组ROS 和MDA 水平均降低（P ＜0.05），SOD 水平升高（P ＜0.05），见图3、表3。2.2.3各组细胞PINK1、Parkin 和LC3蛋白表达水平的比较与Control 组比较，pcDNA3.1组和pcDNA3.1-sCLU 组细胞PINK1、Parkin 蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值差异均无统计学意义，
Control 组H 2O 2组
pcDNA3.1组
H 2O 2+pcDNA3.1组
pcDNA3.1-sCLU 组
H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU 组
Fig.2
Comparison of the apoptosis levels between the six groups
(Bar=100μm)
图2
各组细胞凋亡水平的比较（标志线=100μm ）
组别Control 组H 2O 2组t
sCLU mRNA 1.03±0.050.39±0.0910.700＊＊
CLU 蛋白0.98±0.090.56±0.086.298＊＊
细胞培养上清液sCLU 蛋白（ng/L ）237.90±25.1280.05±17.06
9.002＊＊Tab.1
Comparison of the relative mRNA and protein
levels of CLU in cells ，and the protein levels of sCLU in the medium of H9C2cells between the control group and the
H 2O 2group
表1Control 组和H 2O 2组细胞中sCLU mRNA 和蛋白相对
表达水平、细胞培养上清液中sCLU 蛋白水平的比较
（n =3，x ±s ）
＊＊
P ＜0.01。
Control 组H 2O 2组
CLU
GAPDH
Fig.1Comparison of the protein levels of CLU between the control group and the H 2O 2group
图1
Control 组和H 2O 2组细胞中CLU 蛋白表达水平的比较
组别Control 组pcDNA3.1组pcDNA3.1-sCLU 组H 2O 2组
H 2O 2+pcDNA3.1组H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU 组
F
细胞活力100.00±8.86114.30±8.14112.00±12.48
60.87±8.07abc 58.22±7.35abc 87.41±6.65bcde
23.530＊＊细胞凋亡率4.30±0.646.68±0.695.43±0.62
44.88±6.73abc 39.85±3.88abc 20.41±3.70abcde
78.890＊＊Tab.2Comparison of the viability and apoptosis levels between the six groups of cells
表2各组细胞活力和凋亡率的比较（n =3，
%，x ±s ）＊＊
P ＜0.01；a 与Control 组比较，b 与pcDNA3.1组比较，c
与
pcDNA3.1-sCLU 组比较，d 与H 2O 2组比较，e
reactive oxygen species (ros)与H 2O 2+pcDNA3.1组比
较，P ＜0.05。
H 2O 2组和H 2O 2+pcDNA3.1组细胞PINK1和Parkin 蛋
白表达水平均升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均降低（P ＜0.05），H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU 组PINK1和Parkin 蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值差异均无统计学意义。与H 2O 2组比较，H 2O 2+pcDNA3.1组细胞PINK1和Parkin 蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值差异均无统计学意义，H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU 组PINK1和Parkin 蛋白表达水平降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（P ＜0.05），见图4、表4。
2.3各组细胞活力和凋亡水平的比较（实验3）与
DMSO 组比较，Mdivi-1组细胞活力与细胞凋亡率差异均无统计学意义，H 2O 2+DMSO 组细胞活力下降，而细胞凋亡率升高（P ＜0.05）。与H 2O 2+DMSO 组比较，H 2O 2+Mdivi-1组、H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU 组和H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1组细胞活力均升高，细胞凋亡率均降低（P ＜0.05）。与H 2O 2+Mdivi-1组比较，H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU 组和H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1组细胞活力差异均无统计学意义，细胞凋亡率降低（P ＜0.05）。与H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU 组比较，H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1组细胞活力及细胞凋亡率差异无统计学意义，见表5。3讨论
心血管疾病中，心肌损伤的很大一部分原因来自缺血过程中细胞的氧化应激产生的氧自由基［6］。CL
U 是一种广泛存在于人体组织和体液中，具有分子伴侣活性，可与多种分子结合并发挥多种功能的蛋白［7］。CLU 可分为sCLU 和核型。研究发现，sCLU 参与多种重要的生理过程，包括细胞凋亡［8］、炎症反应［9］、内质网应激反应［10］、细胞黏附及组织修复［11］
组别Control 组pcDNA3.1组pcDNA3.1-sCLU 组H 2O 2组
H 2O 2+pcDNA3.1组H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU 组F
ROS
100.50±7.91
109.10±15.03
95.89±6.37
279.00±39.11abc 289.10±28.31abc 187.70±24.92abcde 44.000＊＊
MDA
100.00±5.6797.29±6.9399.65±5.54
263.40±37.72abc 282.50±32.52abc
171.50±29.50abcde 37.980＊＊
SOD
100.00±6.4498.69±3.28
105.00±8.3456.24±5.13abc 59.78±3.61abc
77.88±5.91abcde
42.240＊＊
Tab.3Comparison of the ROS,MDA and SOD levels between the six groups
表3
各组细胞ROS 、MDA 和SOD 水平的比较
（n =3，%，x ±s ）
＊＊
P ＜0.01；a 与Control 组比较，b 与pcDNA3.1组比较，c
与
pcDNA3.1-sCLU 组比较，d 与H 2O 2组比较，e
与H 2O 2+pcDNA3.1组比
较，P ＜0.05。
pcDNA3.1-sCLU 组H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU 组
pcDNA3.1组
H 2O 2+pcDNA3.1组
Control 组H 2O 2组
Fig.3Comparison of the ROS levels between the six groups (Bar=100μm)
图3
各组细胞ROS 水平的比较（标志线=100μm ）
A ：Control 组；
B ：pcDNA3.1组；
C ：pcDNA3.1-sCLU 组；
D ：H 2O 2组；
E ：H 2O 2+pcDNA3.1组；
F ：H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU 组。Fig.4
The protein levels of PINK1,Parkin and LC3in each group
图4
各组细胞PINK1、Parkin 和LC3蛋白表达水平
PINK1Parkin LC3-ⅠLC3-Ⅱ
GAPDH
A
B
C
D
E
F
组别
Control 组
pcDNA3.1组pcDNA3.1-sCLU 组H 2O 2组
H 2O 2+pcDNA3.1组H 2O 2+pcDNA3.1-sCLU 组F
PINK1
1.00±0.060.98±0.080.92±0.151.96±0.24abc 1.84±0.21abc 1.33±0.09de 26.190＊＊
Parkin
1.00±0.081.07±0.111.12±0.121.95±0.17abc 1.91±0.16abc 1.16±0.14de
33.040＊＊
LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.00±0.041.07±0.091.08±0.10
0.65±0.09abc 0.66±0.12abc 1.08±0.13de 14.180＊＊Tab.4
Comparison of the protein levels of PINK1,Parkin and LC3between the six groups
表4
各组细胞PINK1、Parkin 和LC3蛋白表达水平的比较
（n =3，x ±s ）
＊＊
P ＜0.01；a 与Control 组比较，b 与pcDNA3.1组比较，c
与
pcDNA3.1-sCLU 组比较，d 与H 2O 2组比较，e
与H 2O 2+pcDNA3.1组比
较，P ＜0.05。

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