负载双氢青蒿素的中空介孔二氧化锰纳米颗粒对胰腺癌BxPC-3细胞的杀伤效应
刘
刚 刘明宇 李修靖 余
跃
［摘 要］　目的　探究负载双氢青蒿素（DHA ）的中空介孔二氧化锰纳米颗粒对胰腺癌BxPC-3细胞的杀伤效应。 方法　利用二氧化硅模板法合成了纳米中空介孔二氧化锰，通过DHA 及聚乙二醇-2000（PEG-2000）共孵育后合成了PEG@MnO 2-DHA 和未载药的PEG@MnO 2，并对其进行表征和催化性能验证。利用激光共聚焦显微镜（CLSM ）分别检测0、1、2和4 h 内BxPC-3细胞对纳米颗粒的
摄取情况。采用酶联免疫吸附试验（ELISA ）检测不同氧浓度下经PEG@MnO 2-DHA 处理后BxPC-3细胞内的缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）水平，以探究PEG@MnO 2-DHA 改善肿瘤微环境乏氧情况。最后用噻唑蓝比法（MTT ）和活死细胞染法观察纳米颗粒对BxPC-3细胞的生长抑制作用。 结果　本研究成功制备出粒径约为105 nm 的PEG@MnO 2-DHA ，并且其能够在RPMI-1640培养基（含10%
胎牛血清）中稳定保存。CLSM 结果显示，PEG@MnO 2-DHA 在1h 后就能够被BxPC-3细胞有效摄取。ELISA 结果显示，低氧条件下，使用20 μg/mL 的PEG@MnO 2-DHA 处理后的BxPC-3细胞内HIF-1
α水平与使用磷酸缓冲盐溶液（PBS ）处理后的BxPC-3细胞内HIF-1α水平相比明显下降（P <0.05），略低于常氧条件下PBS 处理后的BxPC-3细胞中HIF-1α水平（P =0.846）。MTT 结果显示，在DHA 浓度为15 μg/mL 时，PEG@MnO 2-DHA 处理组细胞存活率仅为21.81%，低于游离DHA 处理组的46.03%（P <0.05）。 结论　负载DHA 之后的中空介孔二氧化锰纳米颗粒可以被BxPC-3细胞有效摄取，并与释放出来的DHA 反应产生活性氧，同时能改善肿瘤微环境乏氧情况，增强对胰腺癌细胞的杀伤效应。
［关键词］双氢青蒿素；中空介孔二氧化锰；活性氧；胰腺癌doi:10.3969/j.issn.1000-0399.2023.06.001
Killing effect of hollow mesoporous MnO 2 nanoparticles loaded with dihydroartemisinin on pancreatic cancer BxPC-3 cell line LIU Gang 1，LIU Mingyu 1，LI Xiujing 1，YU Yue 2
1.Division of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230031, China
2.Division of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Science and Medicine, University of Science and Tech⁃nology of China, Hefei 230001, China
Funding project: The General Program of National Natural Science Foundation of China （No.31870993）Corresponding author:YU Yue ，***************
[Abstract ] Objective  To investigate the killing effect of hollow mesoporous MnO 2nanoparticlesloaded withdihydroartemisinin (DHA)
on pancreatic cancer BxPC-3 cells. Methods  Hollow mesoporous MnO 2 nanoparticles were synthesized by SiO 2template method. PEG@MnO 2-DHA and PEG@MnO 2 were synthesized by co-incubation with DHA and Polyethylene glycol 2000 (PEG-2000), then characteris‑tics and catalytic properties were investigated. The uptake of nanoparticles by BxPC-3 cells at different time (0,1,2 and 4 h) was detected by la‑ser confocal microscopy (CLSM). The level of HIF-1α in BxPC-3 cells was detected by ELISA assay to investigate the effect of PEG@MnO 2-DHA on hypoxia in tumour microenvironment (TME). Lastly, the growth inhibition of BxPC-3 cells by nanoparticles was observed by MTT as‑
say and cell death staining. Results  PEG@MnO 2-DHA with a particle size of about 105 nm was successfully prepared and could be stably stored in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum. CLSM results showed that PEG@MnO 2-DHA could be efficiently taken up by BxPC-3 cells. ELISA results showed that HIF-1α levels in BxPC-3 cells cultured under hypoxic conditions were significantly reduced after
treatment with PEG@MnO 2-DHA at 20 μg/mL compared with PBS treatment (P <0.05), and the HIF-1α level in BxPC-3 cells was slightly
lower than that in the normoxia group after PBS treatment （P =0.846). MTT results showed that the cell survival rate of the PEG@MnO 2-DHA
· 基础医学 ·
基金项目：国家自然科学基金面上项目(编号：31870993）
作者单位：230031    安徽合肥    安徽中医药大学第一附属医院脾胃科（刘刚，刘铭宇，李修靖）                  230001    安徽合肥    中国科学技术大学附属第一医院（安徽省立医院）消化科（余跃）通信作者：余跃，***************
本文引用格式：刘刚，刘明宇，李修靖，等.负载双氢青蒿素的中空介孔二氧化锰纳米颗粒对胰腺癌BxPC -3细
胞的杀伤效应［J ］.安徽医学，2023，44（6）：623-628.DOI ：10.3969/j.issn.1000-0399.2023.06.001
treated group was only 21.81% at 15 μg/mL DHA concentration, which was lower than46.03% of the free DHA treated group (P<0.05). Con⁃clusions　The hollow mesoporous MnO2 nanoparticles loaded with DHA can be effectively taken up by BxPC-3 cellsand react with the re‑leased DHA to produce reactive oxygen species, which can also improve the lack of oxygen in the tumor microenvironment and enhance the kill‑ing effect on pancreatic cancer cells.
［Key words］ Dihydroartemisinin；Hollow mesoporous MnO2；Reactive oxygen species；Pancreatic cancer
胰腺癌是消化系统常见肿瘤之一，恶性程度极高，5年生存率低［1］。近年来，中药因其广谱抗炎和抗癌活性逐渐吸引了学者们的关注。双氢青蒿素（dihydroarte‑misinin，DHA）是中药青蒿提取物青蒿素经过硼氢化钠还原得到的半合成衍生物，在青蒿素的几种衍生物中表现出较高的抗癌活性。但是由于其水溶性差，生物利用低，半衰期短，导致其应用被限制［2-4］。中空介孔纳米结构因其优秀的载药性能，吸引了广泛的注意［5］。其中，中空介孔二氧化锰纳米递药系统在解决药物水溶性差的同时，能够通过实体瘤的高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention，EPR）在肿瘤部位高效富集［6-7］。研究［8-9］发现，Mn2+能与DHA反应产生具有细胞毒性的活性氧（reactive oxygen species，ROS），继而增强DHA的抗肿瘤作用。本研究旨在构建能够负载DHA的中空介孔纳米颗粒，并研究其被胰腺癌细胞摄取和改善肿瘤部位乏氧情况，及对胰腺癌细胞的杀伤效应，为进一步开发新的
抗胰腺癌药物提供参考。1　材料与方法
1.1　材料　DHA购买自上海晶纯生化科技股份有限公司；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）试剂盒，2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorodihydro‑fluorescein diacetate，DCFH-DA），Hoechst33342购自上海碧云天生物技术有限公司；RPMI-1640培养基，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），胰酶消化液，1×磷酸缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）购买自上海生工公司；BxPC-3细胞株购自上海细胞库。
1.2　方法　
1.2.1　PEG@MnO2-DHA的制备　首先利用二氧化硅模板法［10］合成中空介孔二氧化锰，然后取200 μL的中空介孔二氧化锰溶液（5 mg/mL）与100 μL的DHA溶液（2 mg/mL）混合，超声10 min后，置于气浴震荡器25℃反应过夜，反应结束后收集沉淀，甲醇洗3次除去游离DHA，最后分散在纯水中，得到负载了DHA的中空介孔二氧化锰颗粒（MnO2-DHA）。为了提高MnO2-DHA的稳定性及水溶性，使用聚乙二醇-2000（polyeth‑ylene glycol-2000，PEG-2000）对MnO2-DHA进行表面修饰。取1 mL MnO2-DHA水溶液（5 mg/mL）与1 mL 的PEG-2000（5 mg/mL），超声10 min后37℃孵育过夜，收集沉淀，用水洗涤3次后得到PEG@MnO2-DHA。
1.2.2 PEG@MnO2-DHA的表征　取新制的PEG@MnO2-DHA溶液用去离子水稀释至适当浓度，分别用
透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）和动态光散射仪（dynamic light scattering，DLS）检测其形貌特征。将新制的PEG@MnO2-DHA重新分散在含有10% FBS的RPMI-1640培养液中，并分别在0、1、2、4、8、12、24、36和72 小时取样用DLS测定其水合粒径。随后通过高效液相谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）测量PEG@MnO2-DHA中DHA的载药率和包封率。通过使用不同浓度的DHA 与介孔二氧化锰球共孵育后，用HPLC测量上清液中DHA的含量来间接测量DHA的载药率和包封率。DHA液相测定采用Hedera ODS-C18谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（v ∶ v=60∶40），体积流量1 mL/min，检测波长为210 nm，柱温为室温，进样量20 μL。
1.2.3　DHA的释放　取新制PEG@MnO2-DHA重新分散在pH 7.4，pH 6.0和pH 5.5 的PBS缓冲液，放入透析分子量为14 kDa的透析袋中，然后置于100 mL 的PBS缓冲液中，在不同时间内吸取1 mL透析液，并补充相同体积的缓冲液，利用HPLC测定透析液中DHA的含量。
1.2.4　PEG@MnO2-DHA的催化性能检测　通过使用溶氧仪检测溶液中氧气的含量，来测试PEG@MnO2-DHA在不同条件下催化H2O2分解产生氧气的能力。分别取0、5和10 mg/mL新制的PEG@MnO2-DHA重新分散于含有100 μM H2O2的PBS缓冲液中，用溶氧仪记录溶液中0~10 min的氧气含量。使用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，TMB）作为指示剂，来探讨DHA产生ROS的效率。在pH 7.4或pH 6.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，分别加入0或25 mM的DHA，然
后加入0或50 mM的氯化锰溶液，加入等体积的TMB溶液后室温孵育过夜，用紫外可见分光光度计（ultraviolet-visible spectrophotometer，UV-vis）测量溶液紫外吸收情况。
1.2.5　细胞摄取　使用荧光染料罗丹明B（rhodamine B，RhB）作为示踪剂标记PEG@MnO2-DHA，合成了PEG@MnO2-DHA-RhB。然后将BxPC-3细胞（8×104个/皿）接种于激光共聚焦显微镜（confocal laser scan‑
ning microscope，CLSM）专用培养皿中，用含有10% FBS的RPMI-1640在含有5% CO2的培养箱37℃培养过夜。用含有PEG@MnO2-DHA-RhB（10 mg/mL）的RPMI-1640代替原来的培养基，继续孵育。在指定时间（0、1、2和4 h）后除去含药培养基，PBS洗涤细胞3次。再用含有细胞核染料Hoechst33342（10 mg/mL）的RPMI-1640继续孵育15 min。除去培养基，用PBS洗涤细胞3次后，在CLSM下观察细胞荧光图像。1.2.6　HIF-1α检测　将BxPC-3细胞（5×105个/孔）接种于6孔板中，细胞培养方案同1.2.5（低氧组是将细胞置于厌氧产气袋中孵育过夜）。加入不同浓度（5、10和20 μg/mL）PEG@MnO2-DHA继续孵育24 h。收集细胞并加入细胞裂解液裂解细胞，用蛋白质定量试剂盒测定每组细胞裂解液蛋白浓度。将各组细胞裂解液稀释成相同蛋白浓度后，用HIF-1α的ELISA试剂盒测定各组HIF-1α浓度。HIF-1α试剂盒严格按照说明书进行检测。
1.2.7　细胞内ROS检测　将BxPC-3细胞（8×104个/皿）接种于CLSM培养皿中，细胞培养方案同1.2.5。
分别用含有PBS、游离DHA、PEG@MnO2和PEG@MnO2-DHA的RPMI-1640替代原培养基孵育24 h。除去含药培养基，用含有绿荧光ROS探针DCFH-DA（10 μM）和Hoechst33342（10 mg/mL）的RPMI-1640孵育20 min后，用PBS洗涤3次。在CLSM下观察细胞荧光图像。
1.2.8　纳米颗粒的杀伤作用检测　将BxPC-3细胞接种于96孔板（5×103个/孔）和6孔板（5×105个/孔）中，细胞培养方案同1.2.5。在96孔板中，分别用不同浓度的游离DHA、PEG@MnO2和PEG@MnO2-DHA RPMI-1640孵育48 h后，每孔加入20 μL的MTT溶液（5 mg/mL）。继续孵育4 h后，弃去旧培养基，每孔加入150 μL二甲亚砜，充分溶解后用酶标仪在490 nm处测定其吸光度，并计算细胞存活率。细胞存活率= （药物细胞组OD值－空白对照组OD值）/（不加药细胞组OD值－空白对照组OD值）×100%。然后在六孔板中进行活-死细胞染实验，分别用含有PBS，游离DHA，PEG@MnO2和PEG@MnO2-DHA的RPMI-1640替代原培养基孵育24 h。弃去旧培养基后，加入含有碘化丙啶（10 μM）和荧光素二乙酸酯（5 μM）的RPMI-1640孵育10 min，用倒置荧光显微镜观察各组细胞荧光。1.3　统计学方法　采用 SPSS 23.0进行统计分析，正态分布计量资料以x
-±s表示，两组间均数比较采用t检验，3组及以上均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。2　结果
2.1　PEG@MnO2-DHA表征及稳定性　TEM结果显示，PEG@MnO2-DHA具有中空介孔球形结构，粒
径在105 nm左右（图1A）。DLS结果显示，MnO2-DHA经过PEG修饰之后，粒径从121 nm增加至150 nm（图1B）。在一定浓度范围内，当DHA与介孔二氧化锰球的重量比为2∶1时，此时药物包封率高达95.3%，载药率达65.6%（图1C）。PEG@MnO2-DHA的粒径比较稳定，在72 h内无明显变化（图1D）。
2.2　PEG@MnO2-DHA药物释放效率及催化性能　释放结果显示，在pH 7.4条件下，DHA在48 h内释放最少，仅有14.8%的DHA被释放出来；而在pH 5.5条件下，DHA释放率达80%（图2A）。溶氧仪测量结果显示，在一定浓度的H2O2中，随着PEG@MnO2-DHA浓度的增加，产生的氧气量也越来越多（图2B）。UV-vis结果显示，在DHA 25 mM与Mn2+ 50 mM时，pH 6.5组特征峰最高，但单一的DHA或者Mn2+则几乎看不见特征峰（图2C）。
2.3　细胞摄取实验结果　CLSM结果显示，使用PEG@MnO2-DHA-RhB与细胞孵育1 h后，在细胞中就可以检测到RhB的红荧光，4 h后，显示出最明亮的红荧光（图3）。
reactive oxygen species (ros)
2.4　PEG@MnO2-DHA对细胞内HIF-1α和ROS的影响　与低氧条件下PBS组（Ⅰ组）细胞内HIF-1α水平相比较，常氧条件下PBS组（Ⅴ组）细胞内HIF-1α水平较低（P<0.000 1），20 μg/mL PEG@MnO2-DHA组（Ⅳ组）的细胞内HIF-1α水平显著下降（P<0.001）。
20 μg/mL PEG@MnO2-DHA组（Ⅳ组）的细胞内HIF-
注：A为PEG@MnO2-DHA的TEM特征；B为DLS检测纳米颗粒的粒径；C为不同投料比下DHA的负载率和包封率；D为PEG@MnO2-DHA在血清中的稳定性。
图1　纳米颗粒表征
1α水平略高于常氧条件下PBS 对照组（Ⅴ组）（P =
0.846）（图4A ）。ROS 检测结果显示，与PBS 组相比，PEG@MnO 2几乎未检测到绿荧光，游离DHA 组检测到稍低绿荧光，而PEG@MnO 2-DHA 组表现出最明显的绿荧光（图4B ）。
2.5　PEG@MnO 2-DHA 对BxPC-3细胞的杀伤情况　孵育48 h 后，PEG@MnO 2给药浓度即使为200 μg/mL ，细胞毒性也不明显（图5A ）。当DHA 浓度为15 μg/mL 时，游离DHA 组细胞存活率仍高达46%，但
PEG@MnO 2-DHA 组细胞存活率仅为21.8%，明显低于
游离DHA 组（P <0.000 1）。见图5B 。活死细胞染结
果显示，PEG@MnO 2-DHA 组显示最明亮的红荧光，而PEG@MnO 2组和游离DHA 组仅显示出少量红荧光，甚至红荧光不可见（图5C ）
。
注：A 为不同pH 条件下DHA 的释放情况；B 为溶氧仪检测不同浓度PEG@MnO 2-DHA 催化H 2O 2产生氧气的速率；C 为用TMB 检测
不同条件下DHA 于Mn 2+产生ROS 情况。
图2　DHA
的释放和纳米颗粒的催化性能
图3　CLSM 检测细胞摄取情况
H
I
F
-
1
α
水
平
组别
H o e c h s t
D C F H -D A M e r g e B
注：A 为ELISA 法检测细胞内HIF-1α水平变化（Ⅰ~Ⅳ组是低氧处理，分别是PBS 、5 μg/mL PEG@MnO 2-DHA 、10 μg/mL
PEG@MnO 2-DHA 、20 μg/mL PEG@MnO 2-DHA ，Ⅴ组是常氧处理的PBS 组）；B 为CLSM 检测细胞内ROS 水平变化情况。其中④P <0.000 1。
图4　细胞内HIF-1α和ROS 水平检测
3　讨论
胰腺癌患者早期症状不明显，确诊时已为晚期，又因胰腺处于特殊的解剖位置，周围的肠胃等正常器官对放疗较敏感，所以传统外科手术结合放化疗的效果不理想，严重影响患者生活质量［11］。近年来，纳米递药系统引起了研究人员的广泛注意。纳米递药系统是通过特殊的纳米载体，将一些传统药物吸附或包埋在其中［12］，这种方式能够极大地改善药物溶解性差的问题。纳米尺寸的药物也能通过EPR 效应在肿瘤部位富集，延长药物作用时间，提高药物的靶向性，减少对正常组织的副作用［13］。将传统药物与纳米载体结合起来用于肿瘤，是目前肿瘤研究的热点。
随着人们对纳米材料的深入研究，中空介孔二氧化锰纳米颗粒的肿瘤微环境响应性及改善乏氧的能力也逐渐被研究人员发现［14］。Fang 等［15］利用中空介孔二氧化锰负载阿霉素和光敏剂制备的BMHDC 纳米颗粒，通过触发内源性H 2O 2的分解而充当氧气发生器，从
而克服肿瘤的低氧环境而增强光动力疗法，且BMHDC 纳米颗粒分解出的Mn 2+能通过肾脏快速代谢出体外。这表明中空介孔二氧化锰纳米颗粒是一种成熟的低毒性的纳米材料。目前，对中空介孔二氧化锰纳米颗粒的研究多集中在改善乏氧和响应肿瘤微环境上，而对其与DHA 反应产生ROS 的研究较少。中空介孔二氧化锰纳米颗粒可作为DHA 的纳米载体，既改善DHA 溶解性差的问题，又利用纳米药物的EPR 效应，提高DHA 的生物半衰期。同时，中空介孔二氧化锰纳米颗粒由于其独特的肿瘤微环境响应性，可作为DHA 的控释支架，能减少DHA 的潜在全身毒副作用。
基于中空介孔二氧化锰纳米颗粒特殊的蜂窝状空心结构，可以采用共孵育的方式使DHA 包埋在内部。
而PEG@MnO 2-DHA 表面修饰的PEG 进一步确保
DHA 不会泄露出来，提高了纳米载体的生物相容性。本研究TEM 与DLS 检测显示，PEG@MnO 2-DHA 为150 nm 左右的中空介孔纳米球。药物包封率和载药率决定了纳米载体的载药性能。与利用网状结构或球状结构通过吸附作用负载药物等方式相比，中空介孔结构有效提高了药物负载效率［16］。本研究HPLC 结果显示，PEG@MnO 2-DHA 中DHA 的包封率和载药率高达95.3%和65.6%。Wang 等［17］报道了一种载有功能基因的空心二氧化锰纳米颗粒H-M-pp/C&D ，能在含血清的细胞培养基中稳定存在25 h 。相比之下，经过PEG 表面修饰的PEG@MnO 2-DHA ，其血清稳定性提高至72 h ，这为药物在血液中稳定运输建立了基础。众所周知，乏氧、微酸和高H 2O 2是肿瘤微环境的主要特征［18］。HIF-1α是评估组织缺氧的重要指标［19］。本研究ELISA 结果显示，在低氧条件下培养的BxPC-3细胞经PEG@MnO 2-DHA 处理后，HIF-1α的水平明显下降，这表明PEG@MnO 2-DHA 被细胞内吞之后，催化内源性的H 2O 2产生了氧气，缓解肿瘤部位的乏氧状态。DHA 是一种具有分子内过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物，有广泛的抗癌及抗炎活性［20］。系列研究［21-22］发现，DHA 在Mn 2+的催化下其内过氧桥断裂产生细胞毒性的ROS 。本研究细胞内ROS 检测结果显示，与PBS 组相比，游离DHA 组也显示出一定程度绿荧光，笔者猜测可能是游离DHA 与细胞内源性的Mn 2+反应，产生了ROS 。但PEG@MnO 2-DHA 组绿荧光高于游离DHA 组，这表明了中空介孔二氧化锰纳米颗粒释
放出的Mn 2+与DHA 反应产生了更多的ROS 。最后，MTT 和活死细胞染结果均显示，PEG@MnO 2-DHA 组杀伤作用最强，表明了经过中空介孔二氧化锰负载过后，
DHA 的杀伤作用得到增强，证明了中空介孔二氧化锰
细胞存活率 (%)
DHA 浓度(μg/mL)
PEG@MnO 2的浓度  (m g/mL)
细胞存活率 (%)
A
C
注：A 为MTT 法检测PEG@MnO 2对BxPC-3细胞的杀伤作用；B 为MTT 法检测游离DHA 和PEG@MnO 2-DHA 对BxPC-3细
胞的杀伤作用；C 为活死细胞染法检测不同颗粒对BxPC-3细胞的杀伤作用。其中①为P <0.05，②为P <0.01，③为P <0.001，④
为
P <0.000 1。
图5　细胞杀伤情况

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