第 49 卷第 3 期2023年 5 月吉林大学学报（医学版）
Journal of Jilin University（Medicine Edition）
Vol.49  No.3
May  2023
DOI：10.13481/j.1671‑587X.20230317
缺氧条件下HIF-1α/ROS对肺癌A549细胞凋亡和侵袭的作用
及其机制
黄波1, 丁洁2, 郭红荣1, 王红娟1, 徐建1, 郑泉1
（1. 湖北省武汉市第三医院武汉大学附属同仁医院呼吸与危重症医学科，湖北武汉430070；
2. 湖北省武汉市第三医院武汉大学附属同仁医院血液透析室，湖北武汉430070）
［摘要］目的：探讨缺氧条件下缺氧诱导因子1α（HIF-1α）/活性氧（ROS）对非小细胞肺癌A549细胞凋亡和侵袭的作用，并阐明其相关机制。方法
方法：将A549细胞置于缺氧条件下培养12、24、48和72 h，构建缺氧细胞模型，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测不同处理时间细胞中HIF-1α mRNA表达水平，CCK-8法检测细胞增殖能力，鉴定缺氧细胞模型并确定最佳诱导时间。将A549细胞分为对照组（21%O2）、模型组（缺氧诱导）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）组（20 mmol·L－1 NAC）、NAC+利非西呱（YC-1）组（20 mmol·L－1  NAC+100 μmol·L－1YC-1）和YC-1组（100 μmol·L－1 YC-1）。RT-qPCR和Western blotting法检测各组细胞中HIF-1α和人甲酰肽受体1（FPR1） mRNA及蛋白表达水平，流式细胞术检测各组细胞中ROS水平，透射电镜观察各组细胞自噬体结构，免疫荧光法检测各组细胞中微管相关轻链3Ⅱ（LC3-Ⅱ）表达情况，流式细胞术检测各组细胞凋亡率，Transwell小室实验检测各组侵袭细胞数。结果：随着低氧诱导时间的延长，A549细胞中HIF-1α mRNA表达水平和细胞增殖能力均明显升高（P<0.05或P<0.01），最佳低氧诱导时间为24 h。RT-qPCR和Western blotting法检测，与对照组比较，模型组细胞中HIF-1α和FPR1 mRNA及蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与模型组比较，NAC组、NAC+YC-1组和YC-1组细胞中HIF-1α和FPR1 mRNA及蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）；与NAC组比较，NAC+ YC-1组细胞中HIF-1α和FPR1 mRNA及蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。流式细胞术检测，与对照组比较，模型组细胞中ROS水平明显升高（P<0.01）；与模型组比较，NAC组、NAC+YC-1组和YC-1组细胞中ROS水平均明显降低（P<0.01）；与NAC组比较，NAC+YC-1组细胞中ROS水平明显降低（P<0.01）。透射电镜观察，对照组细胞中细胞器结构完整，未见自噬体结构；模型组细胞中可见大量自噬体和明显空泡，细胞中细胞器被降解；与模型组比较，NAC组、NAC+YC-1组和YC-1组细胞中自噬
体减少，其中NAC+YC-1组细胞中自噬体最少。免疫荧光法检测，与对照组比较，模型组细胞中LC3-Ⅱ表达强度明显增加；与模型组比较，NAC组、NAC+YC-1组和YC-1组细胞中LC3-Ⅱ表达强度明显减少。流式细胞术检测，与对照组比较，模型组细胞凋亡率明显降低（P<
0.01）；与模型组比较，NAC组、NAC+YC-1组和YC-1组细胞凋亡率明显升高（P<0.01）；与
NAC组比较，NAC+YC-1细胞凋亡率明显升高（P<0.01）。Transwell小室实验检测，与对照组比较，模型组侵袭细胞数明显增加（P<0.01）；与模型组比较，NAC组、NAC+YC-1组和YC-1组侵袭细胞数均明显减少（P<0.01）；与NAC组比较，NAC+YC-1组侵袭细胞数明显减少（P<0.01）。
结论
结论：：缺氧条件下抑制HIF-1α/ROS可促进肿瘤细胞凋亡，并抑制细胞侵袭，其作用机制与抑制肺癌细胞自噬有关。
［关键词］缺氧；缺氧诱导因子1α；活性氧；自噬；癌，非小细胞肺
［中图分类号］R734.2        ［文献标志码］A
[文章编号] 1671‑587X(2023)03‑0682‑09
[收稿日期]2022‑07‑15
[基金项目]湖北省卫健委科研项目（WJ2021F005）；湖北省武汉市卫健委医学科研项目（WX21Q43）；湖北省武汉市中青年医学骨干人才培养工程项目［武卫通（2019）87号］
[作者简介]黄波（1982－），男，广西壮族自治区贵港市人，副主任医师，医学硕士，主要从事肺癌基础和临床方面的研究。[通信作者]黄波，副主任医师（E-mail：*********************）
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683黄波，等. 缺氧条件下HIF‑1α/ROS对肺癌A549细胞凋亡和侵袭的作用及其机制
Effects of HIF-1α/ROS on apoptosis and invasion of lung
cancer A549 cells under hypoxia and its mechanism
HUANG Bo1, DING Jie2, GUO Hongrong1, WANG Hongjuan1, XU Jianqun1, ZHENG Quan1（1. Department of Respiratory and Critical Care Medicine， Wuhan Third Hospital，Hubei Province，Affiliated Tongren Hospital，Wuhan University， Wuhan 430070， China；2. Hemodialysis Room， Wuhan Third Hospital，Hubei Province，Affiliated Tongren Hospital，Wuhan University， Wuhan 430070， China）
ABSTRACT Objective：To discuss the effect of hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α）/ reactive oxygen species （ROS） on the apoptosis and invasion of the non-small cell lung cancer A549 cells，and to clarify  the related mechanism.Methods：The A549 cells were cultured under hypoxia condition for 12，24，48 and 72 h to construct the hypoxia cell model. The expression levels of HIF-1α mRNA in the cells at different treatment time were detected by real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR）method，and the proliferation abilities of the cells were detected by CCK-8 assay；the hypoxia cell model was verified，and the optimal induction time was determined.The A549 cells were divided into control group（21%O2），model group（hypoxia induction），NAC group（20 mmol·L－1NAC），NAC+YC-1 group（20 mmol·L－1 NAC+100 μmol·L－1YC-1）and YC-1 （100 μmol·L－1YC-1）group.The expression levels of HIF-1α and FPR1 mRNA and proteins were detected by RT-qPCR and Western blotting methods； the ROS levels were detected by flow cytometry；the autophagosome structure in the cells was observed by transmission electron microscope； the expressions of microtubule-associated protein light china 3 Ⅱ（LC3-Ⅱ） in the cells in various groups were detected by immunofluorescence；the apoptotic rates of the cells in various groups were detected by flow cytometry；and the number of  invasion cells was detected by Transwell chamber assay.Results：With the prolongation of hypoxia induction time， the HIF-1α mRNA expression levels in the A549 cells and cell proliferation abilities were increased（P<0.05 or P<0.01）， and the optimal
hypoxia induction time was 24 h.The results of  RT-qPCR and Western blotting methods showed that compared with control group，the expression levels of HIF-1α and FPR1 mRNA and proteins in the cells in model group were significantly increased（P<0.01）； compared with model group，the  expression levels of HIF-1α and FPR1 mRNA and proteins in the cells in NAC group，NAC+YC-1 group and YC-1 group were significantly decreased（P<0.01）.Compared with control group，the level of ROS in the cells in model group  was significantly increased （P<0.01）； compared with model group，the ROS levels in the cells in NAC group， NAC+YC-1 group， and YC-1 group were significantly decreased（P<0.01）；compared with NAC group，the ROS level in the cells in NAC+YC-1 group was significantly decreased（P<0.01）.The transmission electron microscope results showed that the organelle structure of the cells in control group was intact and no autophagosome structure was seen； a large number of autophagosomes were seen in the cells in model group， obvious vacuoles were visible， and intracellular organelles were degraded； compared with model group，the number of autophagosomes in the cells in NAC group，NAC+YC-1 group and YC-1 group were decreased，among them the autophagosomes in the cells in NAC+YC-1 group were the least. The immunofluorescence assay results showed that the expression intensity of LC3-Ⅱ in the cells in model group was significantly increased compared with control group， and the expression intensities of LC3-Ⅱ in the cells in NAC group，NAC+YC-1 and YC-1 group were signfican
tly decreased compared with model group.Compared with control group，the apoptotic rate of the cells in model group was significantly decreased（P<0.01）； compared with model group， the apoptotic rates of the cells in  NAC group， NAC+ YC-1 group and YC-1 group were significantly increased（P<0.01）；compared with NAC group，the apoptotic rate of the cells in NAC+YC-1 group was increased（P<0.01）.The results of  Transwell
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reactive oxygen species (ros)吉林大学学报（医学版）
chamber assay showed that  compared with control group the number of the invasion cells in model group was significantly increased（P<0.01）； compared with model group， the numbers of  invasion cells in NAC group， NAC+YC-1 group and YC-1 group were significantly decreased （P<0.01）；compared with NAC group，the number of the in vasion cells in NAC+YC-1 group was decreased（P<0.01）. Conclusion：Inhibition of HIF-1α/ROS under hypoxia condition can promote the apoptosis and inhibit cell invasion of  cancer cells，and its mechanism may be realted to  inhibiting the autophagy of lung cancer cells. KEYWORDS Hypoxia；Hypoxia inducible factor-1α；Reactive oxygen species；Autophagy；Cancer，non-small cell lung
肺癌是癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌发病率约占全部肺癌发病率的85%。肺癌具有较高的死亡率和发病率，因此其早期诊断十分重要［1-2］。随着人们生活方式的改变和社会经济的发展，肺癌的发病率逐年升高，给人类健康造成极大威胁［3］。以顺铂为基础的化疗是目前肺癌的主要方法，但化疗药物缺乏特异性且具有明显不良反应，因此寻新的靶点对肺癌诊断和具有重要意义［4］。
研究［5］表明：缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在肺癌患者血清中的表达明显上调。常氧条件下，HIF-1α表达的蛋白会被迅速降解，而缺氧条件下降解途径被破坏，肿瘤细胞中的HIF-1α通过调控糖酵解途径相关酶的表达促进葡萄糖代谢为乳酸，使HIF-1α能够在缺氧环境中生存［6］。自噬在人类肿瘤等疾病的过程中发挥关键作用［7］。缺氧条件下，活性氧（reactive oxygen species，ROS）和HIF-1α均可诱导自噬，并影响肿瘤的进展［8-9］，但在肺癌中的具体作用机制尚不明确。因此，本研究以A549细胞作为研究对象，构建缺氧细胞模型，探讨HIF-1α和ROS的相互作用及其对A549缺氧细胞模型自噬及生物学行为的影响，为肺癌的靶点提供参考。
1 材料与方法
1.1　细胞、器
主要试剂和仪器  人非小细胞肺癌A549细胞购于中科院细胞库。HIF-1α抑制剂利非西呱（lificiguat，YC-
1）和ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，F12K和胎牛血清购于美国Gibco公司，CCK-8试剂、抗荧光衰减封片剂、结晶紫和BCA蛋白浓度测定试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司，TRIzol试剂购于美国Ambion公司，SYBR FAST qPCR Master Mix购于美国KAPA Biosystems公司，反转录试剂盒购于日本TaKaRa公司，ROS检测试剂盒购于上海碧云天生
物技术有限公司，荧光集团488标记的羊抗兔抗体、微管相关蛋白轻链3Ⅱ（microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）、HIF-1α和人甲酰肽受体1（formy peptide receptor，FPR1）抗体购于武汉贝茵莱生物科技有限公司，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡检测试剂盒和Matrigel购
于美国BD公司，PVDF转移膜和化学发光试剂购于美国Millipore公司。CO2恒温培养箱（311）和直热式CO2三气培养箱（Forma TM 8000）购于美国Thermo公司，倒置荧光显微镜（DMIL LED）和
切片机（S6E）购于德国Leica公司，PCR仪（GE48527）购于杭州柏恒科技有限公司，实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪（CFX-Connect 96）和电泳仪（mini protean 3 cell）购于美国Bio-Rad公司，超微量分光光度计（Nano-300）购于杭州奥盛仪器有限公司，流式细胞仪（NovoCyte）购于杭州艾森生物有限公司，透射电镜（HT7700）购于日本日立公司，酶标仪（MK3）购于芬兰雷勃公司，全自动化学发光分析仪（Tanon-5200）购于上海天能科技有限公司。
1.2　细胞培养和缺氧细胞模型构建
细胞培养和缺氧细胞模型构建  采用含10%胎牛血清的F-12K培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养A549细胞，细胞汇合度达80%时，按1∶2比例进行传代。收集细胞，调整细胞悬液浓度，接种于6孔细胞培养板中，每孔5×105个细胞，每孔2 mL，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，取对数生长期的细胞，更换无血清培养液培养12 h，使细胞周期同步化，将细胞置于含94% N2、1% O2和5% CO2混合气体的缺氧培养箱中培养12、24、48和72 h，收集细胞进行后续检测［10］。
1.3　定
模型鉴定  以常氧培养（21% O2）的A549细胞作为对照，RT-qPCR法检测不同处理时间细胞中HIF-1α mRNA表达水平，TRIzol法提取细胞
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黄波，等. 缺氧条件下HIF‑1α/ROS对肺癌A549细胞凋亡和侵袭的作用及其机制
总RNA，按照逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA，RT-qPCR法检测细胞中HIF-1α mRNA表达水平。引物序列：HIF-1α F 5'-GAAGTGTA-CCCTAACTAGCCG-3'，HIF-1α R 5'-TCAC-AAATCAGCACCAAGC-3'；GAPDH F 5'-GG-GAAACTGTGGCGTGAT-3'，GAPDH R 5'-GA-GTGGGTGTCGCTGTTGA-3'。以
GAPDH为内参，采用2－△△Ct法计算HIF-1α mRNA表达水平。取出细胞培养板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培养4 h，酶标仪检测波长450 nm处各孔吸光度（A）值，以A值代表细胞增殖能力，实验重复3次。缺氧条件下细胞增殖能力较好，HIF-1α高表达表明缺氧诱导细胞模型构建成功，并由此确定最佳诱导时间。1.4　细胞分组和处理
细胞分组和处理  将A549细胞分为对照组、模型组、NAC组、NAC+YC-1组和YC-1组。对照组细胞在常氧（21% O2）条件下培养，其余4组细胞均按照“1.3”步骤中方法诱导24 h；模型组只进行缺氧诱导，不做其他处理；NAC组缺氧诱导后采用20 mmol·L－1 NAC诱导24 h［8］；NAC+ YC-1组缺氧诱导后采用20 mmol·L－1NAC和100 μmol·L－1 YC-1诱导24 h［11］；YC-1组缺氧诱导后采用100 μmol·L－1 YC-1诱导24 h。干预完成后，进行后续实验。
1.5　RT-qPCR法和Western blotting法检测各组细胞中HIF-1α和FPR1 mRNA平
及蛋白表达水平  收集细胞，TRIzol法提取细胞总RNA，RT-qPCR法检测各组细胞中HIF-1α和FPR1 mRNA表达水平。引物序列：HIF-1α上游引物，5'-TGCTTGGTGCTGATTTGTG-3'，HIF-1α下游引物，5'-TGTCCTGTGGTGACTTGTCC-3'；FPR1上游引物，5'-GTCGCAGCAGCCTTTT-TT-3'，FPR1下游引物，5'-CCAGGGCACTTG-TCACATC-3'；GAPDH上游引物，5'-GGGAAA-CTGTGGCGTGAT-3'，GAPDH下游引物，5'-G-AGTGGGTGTCGCTGTTGA-3'。以GAPDH为内参，采用2－△△Ct法计算各组
细胞中HIF-1α和FPR1 mRNA表达水平。同时提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白含量，Western blotting法检测各组细胞中HIF-1α和FPR1蛋白表达水平，采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，实验重复3次，以GAPDH为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。1.6　流式细胞术检测各组细胞中ROS水平
水平  采用无血清培养液按照1∶1 000的比例稀释DCFH-DA，使终浓度为10 μmol·L－1。采用1 mL稀释的DCFH-DA重悬细胞，使细胞浓度为1×106 mL－1，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内孵育20 min，使探针和细胞充分接触。无血清细胞培养液洗涤3次，收集细胞并用500 μL PBS缓冲液重悬，采用流式细胞仪检测荧光强度。以荧光强度表示各组细胞中ROS水平。
1.7　构
透射电镜观察各组细胞自噬体结构  取1×107个细胞，采用2.5%戊二醛4 ℃预固定30 min以上，PBS缓冲液洗涤3次，1%锇酸后固定1 h，PBS缓冲液洗涤3次后进行梯度脱水，丙酮和环氧树脂812按照1∶1的比例40 ℃半浸透6 h，纯环氧树脂40 ℃全浸透4 h，包埋板包埋，加入包埋剂，置于聚合包埋箱聚合，采用切片机进行超薄切片。醋酸铀避光染20 min，双蒸水洗涤3次，枸橼酸铅避光染15 min，洗去多余铅液，吸干后透射电镜观察并拍照，实验重复3次。
1.8　免疫荧光法检测各组细胞中LC3-Ⅱ表达情况　收集各组细胞接种于12孔细胞培养板，加入1 mL 4
%多聚甲醛室温固定30 min，PBS缓冲液洗涤2次，加入1 mL 0.5%Triton X-100室温通透30 min，PBS缓冲液洗涤2次，加入1 mL 5%BSA 37 ℃封闭1 h，弃封闭液，加入一抗稀释液，4 ℃孵育过夜，PBS缓冲液洗涤后加入二抗稀释液，37 ℃孵育1 h，PBS缓冲液洗涤后加入含DAPI的抗荧光淬灭封片液，置于荧光显微镜下拍照并记录，实验重复3次。
1.9　流式细胞术检测各组细胞凋亡率
流式细胞术检测各组细胞凋亡率  收集各组细胞，取1×106个培养基重悬的细胞，400 g、4 ℃离心5 min，弃上清，加入1 mL预冷的PBS缓冲液，混匀后弃上清，200 μL PBS缓冲液重悬细胞，加入10 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI，混匀后4 ℃避光孵育30 min，加入300 μL PBS缓冲液，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。细胞凋亡率=（右上象限凋亡细胞数+右下象限凋亡细胞数）/细胞总数×100%。
1.10　Transwell数
小室实验检测各组侵袭细胞数  收集各组细胞，采用无血清培养基重悬细胞至1×105mL－1，稀释基质胶并铺在Transwell小室中，干燥后取200 μL细胞悬液接种于Transwell小室中，下层24孔细胞培养板中每孔加入0.75 mL
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吉林大学学报 （医学版）  含10% 胎牛血清培养液，培养24 h ，加入4%多聚甲醛室温固定30 min ，PBS 缓冲液洗涤，加入1 mL 0.5%结晶紫溶液，染30 min ，取出小室，用棉签擦去上层细胞，光学显微镜下观察并计数，采用Image J 软件计算各组侵袭细胞数，实验重复3次。1.11　统计学分析统计学分析  采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行统计学分析。不同处理时间各组细胞中HIF -1α和FPR1 mRNA 表达水平，各组细胞中HIF -1α和FPR1蛋白表达水平，各组细胞中ROS 水平，不同处理时间各组细胞增殖能力，各组细胞凋亡率和侵袭细胞数均符合正态分布且方差齐，以x ±s 表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD -t 检验。以P <0.05为差异有统计学意义。2 结  果
2.1　缺氧环境下A549细胞HIF -1α mRNA 表达水平和增殖能力平和增殖能力  与0 h 比较，低氧诱导12、24、48和72 h 时，细胞中HIF -1α mRNA 表达水平明显升高（P <0.05或P <0.01），随着A549细胞在低氧环境中的时间延长，HIF -1α mRNA 表达水平升高。与对照组比较，低氧诱导24、48和72 h 时，模型组细胞增殖能力明显升高（P <0.01）。结合两部分结果确定低氧诱导时间为24 h 。见图1和2。2.2　各组A549细胞中HIF -1α和FPR1 mRNA 及平蛋白表达水平  与对照组比较，模型组细胞中HIF -1α和FPR1 mRNA 及蛋白表达水平均明显升高（P <0.01）。与模型组比较，NAC 组、NAC+YC -1组和YC -1组细胞中HIF -1α和FPR1 mRNA 及蛋白表达水平均明显降低（P <0.01），其中NAC+YC -1组细胞中HIF -1α和FPR1 mRNA 表达水平最低。与NAC 组比较，NAC+YC -1组细胞
中HIF -1α和FPR1 mRNA 及蛋白表达水平明显降低（P <0.01）。见图3和4。
2.3　各组A549细胞中ROS 水平水平  与对照组比较，模型组细胞中ROS 水平明显升高（P <0.01）。与模型组比较，NAC 组、NAC+YC -1组和YC -1
组
*
P <0.05， **P <0.01 compared with 0 h.
图1　缺氧条件下A549细胞中HIF -1α mRNA 表达水平Fig. 1　Expression levels of HIF -1α mRNA  in A549 cells
under hypoxia condition
1：Control group ；B ：Model group ；3：NAC group ；4：NAC+YC -1 group ；5：YC -1 group. *P <0.01 compared with control group ； △P <0.01 compared with model group ； #P <0.01 compared with NAC group.
图3　各组细胞中HIF -1α(A)和FPR1(B) mRNA 表达水平
Fig. 3　Expression levels of HIF -1α（A) and FPR1（
B) mRNA in cells in various groups
*P <0.01 compared with control group.
图2　缺氧条件下A549细胞增殖能力
Fig. 2　Proliferation activities of A549 cells under hypoxia
condition
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