第 49 卷第 4 期2023年 7 月
吉林大学学报（医学版）
Journal of Jilin University（Medicine Edition）
Vol.49  No.4
Jul.2023
DOI：10.13481/j.1671‐587X.20230420
黄芩素对人舌鳞状细胞癌CAL27细胞增殖的抑制作用及其机制史乃旭1, 郝苗2, 张天夫1, 赵柯林3, 黄子嫣1, 李春艳4, 王晓峰1
（1. 吉林大学中日联谊医院口腔科，吉林长春130033；2. 吉林大学中日联谊医院科研中心，吉林长春130033；3. 吉林大学中日联谊医院风湿免疫科，吉林长春130033；
4. 新乡医学院第一附属医院口腔颌面外科，河南新乡453100）
［摘要］目的
目的：探讨黄芩素对人舌鳞状细胞癌（简称舌鳞癌）CAL27细胞增殖的影响，阐明其潜在的作用机制。方法
方法：将对数生长期CAL27细胞分为对照组和不同浓度（12.5、25.0、50.0、100.0和200.0 μmol·L－1）黄芩素组，采用结晶紫染法观察各组细胞克隆形成情况，CCK-8法检测各组细胞增殖率，2'，7'-二氢二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针检测各组细胞中活性氧（ROS）水平，罗丹明123（Rhodamine123）荧光探针检测各组细胞线粒体膜电位（MMP）水平。对数生长期CAL27细胞分为对照组和不同浓度（50、100和200 μmol·L－1）黄芩素组，采用流式细胞术检测各组不同细胞周期细胞百分率和细胞凋亡率。对数生长期CAL27细胞分为对照组、不同浓度（50和100 μmol·L－1）黄芩素组、N-乙酰半胱氨酸（NAC）组、50 μmol·L－1黄芩素+NAC组和100 μmol·L－1黄芩素+NAC组，采用DCFH-DA荧光探针和Rhodamine123荧光探针分别检测黄芩素与NAC联合作用后各组细胞中ROS和MMP水平。结果
结果：结晶紫染，与对照组比较，不同浓度黄芩素组细胞克隆形成数呈浓度依赖性减少，200 μmol·L－1黄芩素组细胞几乎无克隆形成。CCK-8法检测，与对照组比较，不同浓度黄芩素组细胞增殖率明显降低（P<0.05或P<0.01），且呈浓度依赖性。与对照组比较，不同浓度黄芩素组细胞中ROS水平明显升高（P<0.05），MMP水平明显降低（P<0.05）。与对照组比较，不同浓度黄芩素组细胞中S期细胞百分率明显升高（P<0.05），G0/G1期细胞百分率明显降低（P<0.05），细胞凋亡率明显升高（P<0.05）
。黄芩素与NAC联合作用后，与对照组比较，50和100  μmol·L－1黄芩素组细胞中ROS水平明显升高（P<0.05），MMP水平明显降低（P<0.05）；
分别与50和100 μmol·L－1黄芩素组比较，50 μmol·L－1黄芩素+NAC组和100 μmol·L－1黄芩素+NAC组细胞中ROS水平明显降低（P<0.05），MMP水平明显升高（P<0.05）。结论
结论：黄芩素可以通过激活线粒体氧化应激通路抑制CAL27细胞增殖。
［关键词］黄芩素；口腔鳞状细胞癌；细胞周期；活性氧；线粒体膜电位
［中图分类号］R739.86［文献标志码］A
Inhibitory effect of baicalein on proliferation of human tongue
squamous cell carcinoma CAL27 cells and its mechanism
SHI Naixu1, HAO Miao2, ZHANG Tianfu1, ZHAO Kelin3, HUANG Ziyan1,
LI Chunyan4, WANG Xiaofeng1
（1. Department of Stomatology， China-Japan Union Hospital， Jilin University， Changchun 13003
3，China；2. Scientific Research Center， China-Japan Union Hospital， Jilin University， Changchun 130033，[文章编号] 1671‐587X(2023)04‐0985‐09
[收稿日期]2023‐01‐10
[基金项目]吉林省财政厅卫生科研人才专项项目（2021SCZ28）
[作者简介]史乃旭（1997－），女，吉林省长春市人，在读硕士研究生，主要从事口腔肿瘤发病机制方面的研究。[通信作者]李春艳，医师（E-mail：*****************）；
王晓峰，主任医师，教授，博士研究生导师（E-mail：********************）
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China；3. Department of Rheumatology and Immunology， China-Japan Union Hospital， Jilin University， Changchun 130033， China；4. Department of Oral and Maxillofacial Surgery，First Affiliated Hospital，Xinxiang Medical University， Xinxiang 453100， China）
ABSTRACT Objective：To discuss the effect of baicalin on the proliferation of the human tongue squamous cell carcinoma （tongue squamous cell carcinoma）CAL27 cells，and to clarify its potential mechanism. Methods：The CAL27 cells at logarithmic growth phase were divided into control group and different concentrations （12.5， 25.0， 50.0， 100.0， and 200.0 μmol·L－1） of baicalein groups， the clone formation of cells in various groups was observed by crystal violet staining；the proliferation rates of cells in various groups were detected by CCK-8 method；the levels of reactive oxygen species （ROS）in cells in vaious groups were detected by 2'，7'-dichlorofluorescein diacetate （DCFH-DA）fluorescence probe；the mitochondrial membrane potential （MMP）of cells in various groups were detected by Rhodamine 123 fluorescence probe.The CAL27 cells at logarithmic growth phase were divided into control group and different concentrations （50，100，and 200 μmol·L－1）of baicalin groups.Flow cytometry was used to detect the percentages of the cells at different cell cycles and the apoptotic rates of cells in various groups. The CAL27 cells at logarithmic growth phase were divided into control group and different concentrations （50 and 100 μmol·L－1）of baicalein groups，N-neneneba acetylcysteine （NAC）group，50 μmol·L－1 baicalin+NAC group，and 100 μmol·L－1 baicalin+NAC group. The levels of ROS and MMP of cells in vraious groups were detected by DCFH-DA fluorescence probe and Rhodamine 123 fluorescence probe. Results： The crystal violet staining results showed that compared with control gr
oup， the numbers of clone formation of the cells in different concentrations of baicalin groups were decreased in a concentration-dependent manner，and there was almost no clone formation of the cells in 200 μmol·L－1baicalin group. The CCK-8 assay results showed that compared with control group，the proliferation rates of the cells in different concentrations of baicalin groups were significantly decreased in a concentration-dependent manner （P<0.05 or P<0.01）.Compared with control group，the ROS levels of the cells in different concentrations of baicalin groups were significantly increased（P<0.05）and the MMP levels were significantly decreased （P<0.05）. Compared with control group， the percentages of the cells at S phase in different concentrations of baicalin groups were significantly increased（P<0.05），the percentages of the cells at G0/G1phase were significantly decreased （P<0.05），and the apoptotic rates were significantly increased （P<0.05）. After the combination of baicalein and NAC， compared with control group，the ROS levels of the cells in 50 and 100 μmol·L－1 baicalein groups were significantly increased （P<0.05） and the MMP levels were significantly decreased （P<0.05）；compared with 50 and 100 μmol·L－1baicalein groups， the ROS levels of the cells in 50 μmol·L－1 baicalein+NAC group and 100 μmol·L－1 baicalein+ NAC group were significantly decreased （P<0.05），and the MMP levels were significantly increased （P< 0.05）.Conclusion：Baicalein can inhibit the proliferation of the CAL27 cells by activating the mitochondrial oxidative stress pathway.
KEYWORDS Baicalien；Oral squamous cell carcinoma；Cell cycle；Reactive oxygen species；Mitochondrial membrane potential
口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，其中以舌鳞状细胞癌（简称舌鳞癌）最为常见，临床上通常表现为难以愈合的口腔溃疡，严重者伴有咀嚼疼痛、吞咽和发音障碍等，严重影响患者的生活质量［1］。目前，OSCC的主要是手术切除辅以放疗和化疗［2］。但OSCC极易复发和转移，患者预后不良，效果并不理想［1］。因此，寻效果明显且毒副作用小的药物，提高患者生存率和改善患者预后是近年来研究的热点。黄芩素是从黄芩根中提取的生物活性类黄酮，也是黄芩根中最主要的活性成分，具有多种生物学特性和药
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史乃旭，等. 黄芩素对人舌鳞状细胞癌CAL27细胞增殖的抑制作用及其机制
理活性［3］。黄芩素具有抗凋亡和抗氧化作用，可减轻心脏肥大和缓解肝脏损伤［4-5］，还能减轻肾纤维化，缓解炎症性肠病，发挥抗炎作用［6］。研究［7-8］显示：黄芩素通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡，还可增强乳腺癌细胞对抗癌药物他莫昔芬的敏感性。GAO等［9］发现：黄芩素通过调控相关信号通路和诱导细胞周期阻滞进而抑制OSCC细胞生长。另有研究［10］显示：黄芩素可通过调节自噬相关通路促进CAL27细胞
凋亡。但目前国内外关于黄芩素抑制人舌鳞癌细胞增殖的具体机制尚不十分明确，限制了黄芩素在临床中的应用。本研究拟从线粒体氧化应激途径探讨黄芩素对人舌鳞癌CAL27细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）和线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）水平的影响，分析其潜在作用机制，为开发以黄芩素为原料的OSCC靶向药物提供理论依据。
1　材料与方法
1.1 细胞、主要试剂和仪器人舌鳞癌CAL27细胞株（美国ATCC细胞库）。DMEM培养基（美国Gbico公司），青-链霉素和胎牛血清（中国Biosharp公司），黄芩素（上海爱必信生物科技有限公司），二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（北京索莱宝科技有限公司），CCK-8检测试剂盒、 N-乙酰半胱氨酸（ N-acetyl cysteine，NAC）、TRIzol和结晶紫染液（南京碧云天生物技术有限公司），细胞凋亡检测试剂盒（天津三箭生物技术有限公司），碘化丙啶（propidium iodide，PI）和核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）（江苏凯基生物技术股份有限公司）。恒温培养箱（德国Heraeus公司），酶标仪（美国BioTek公司），流式细胞仪（美国Beckman公司），Odyssey红外成像系统（美国LI-COR公司）。
1.2 细胞培养CAL27细胞在含10%胎牛血清和1%青-链霉素溶液的DMEM培养基中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每隔48 h传代或更换培养基。取对数生长期细胞进行实验。
1.3 结晶紫染法观察各组CAL27细胞克隆形成情况CAL27细胞以5×102 mL－1密度接种于6孔细胞培养板中，细胞贴壁后，采用不同浓度（1
2.5、25.0、50.0、100.0 和200.0 μmol·L－1）
黄芩素处理CAL27细胞48 h，同时设对照组。PBS缓冲液漂洗2次后甲醇固定15 min。弃甲醇干燥后，每孔加入500 μL结晶紫染液染15 min，PBS缓冲液漂洗晾干后，肉眼观察各组细胞克隆形成情况并拍照。
1.4 CCK-8法检测各组CAL27细胞增殖率
CAL27细胞以1×104 mL－1密度接种于96孔细胞培养板中，细胞分组和处理方法见“1.3”，另设空白组。每孔加入10 μL CCK-8溶液，在恒温培养箱中避光孵育2 h，采用酶标仪在450 nm波长处检测各组细胞吸光度（A）值，计算细胞增殖率。细胞增殖率=（实验组A值－空白组A值）/（对照组A值－空白组A值）×100%。
1.5 2'，7'-酯
二氢二氯荧光素二乙酸酯（（2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）荧光探针检测各组CAL27细胞中ROS水平细胞分组和处理方法见“1.3”。同时，为明确细胞中ROS水平上调是否为黄芩素
抑制CAL27细胞增殖的主要原因，将ROS清除剂NAC与不同浓度黄芩素共同作用CAL27细胞后检测各组细胞中ROS水平，对数生长期CAL27细胞分为对照组、不同浓度（50和100 μmol·L－1）黄芩素组、NAC （5 μmol·L－1）组、50 μmol·L－1黄芩素+NAC组和100 μmol·L－1黄芩素+NAC组。收集各组细胞，PBS缓冲液漂洗2次后，每个样品中加入10 μmol·L－1 DCFH-DA染液1 mL重悬细胞，避光，恒温培养箱孵育30 min后离心弃去染液，500 μL PBS 缓冲液重悬细胞后，采用流式细胞仪检测各组CAL27细胞中 ROS水平。
1.6 罗丹明123（Rhodamine 123）荧光探针检测各组CAL27细胞中MMP水平细胞分组和处理方法见“1.5”。收集各组细胞，PBS缓冲液漂洗2次后，每个样品中加入2 μmol·L－1 Rhodamine123染液200 μL重悬细胞，恒温培养箱孵育20 min后离心弃去染液，PBS缓冲液500 μL重悬细胞后，采用流式细胞仪检测各组CAL27细胞中MMP 水平。
1.7 流式细胞术检测各组不同细胞周期CAL27细胞百分率CAL27细胞以5×105 mL－1密度接种于6孔细胞培养板中，过夜培养细胞至贴壁后，分别采用50、100 和200 μmol·L－1黄芩素处理CAL27细胞48 h，同时设对照组。预冷PBS缓冲液洗2次后，每孔加入500 μL不含EDTA的胰酶消化并收
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吉林大学学报 （医学版）  集细胞，离心后采用PBS 缓冲液漂洗1次，按照细胞周期检测试剂盒说明书配制染液，每管加入含有20 mg ·L －1 PI 和200 mg ·L －1 RNase 的染液，避光孵育30 min 后上机检测各组不同细胞周期细胞百分率。1.8
流式细胞术检测各组CAL27细胞凋亡率
CAL27细胞按照1×106
mL －1
密度接种于6孔细胞培养板中，过夜培养细胞至贴壁后，细胞分组和处理方法见“1.7”。收集各组细胞，1×binding buffer 500 μL 重悬，每个样品中加入5 μL Annexin Ⅴ溶液和5 μL PI 溶液，室温下避光孵育30 min ，200目滤网过滤，采用流式细胞术按照Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染凋亡检测试剂盒说明上机检测各组细胞凋亡率。
1.9 统计学分析 采用SPSS 25.0统计软件进行
reactive oxygen species (ros)
统计学分析。各组CAL27细胞增殖率、ROS 水平、MMP 水平、不同细胞周期细胞百分率和凋亡率均符合正态分布，以x±s 表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK -q 检验。以P <0.05为差异有统计学意义。2　结    果　
2.1 各组CAL27细胞克隆形成情况和细胞增殖率  处理CAL27细胞48 h 后，随黄芩素浓度增加，CAL27细胞增殖受到抑制，与对照组比较，不同浓度黄芩素组细胞克隆形成数呈浓度依赖性减少，200.0 μmol ·L －1黄芩素组细胞几乎无克隆形成。见图1。与对照组比较，不同浓度黄芩素组细胞增殖率呈浓度依赖性降低（P <0.05或P <0.01），与克隆形成实验结果一致。见图2。
2.2 各组CAL27细胞中ROS 和MMP 水平 与对照组比较，处理CAL27细胞48 h 后，不同浓度黄芩素组CAL27细胞中ROS 水平呈浓度依赖性升高
（P <0.05），MMP 水平呈浓度依赖性降低（P <0.05）。见表1。
2.3 各组不同细胞周期CAL27细胞百分率 处理CAL27细胞48 h 后，与对照组比较，不同浓度
黄
A ： Control group ；
B ： 12.5 µmol ·L －1 baicalein group ；
C ： 25.0 µmol ·L －1 baicalein group ；
D ： 50.0 µmol ·L －1 baicalein group ；
E ： 100.0 µmol ·L －1 baicalein group ；
F ： 200.0 µmol ·L －1 baicalein group.
图1　结晶紫染法检测各组CAL27细胞克隆形成情况
Fig. 1　
Clone formations of CAL27 cells in various groups detected by crystal violet staining
*
P <0.05 ，**
P <0.01 compared with control group.
图2　CCK -8法检测各组CAL27细胞增殖率Fig. 2　Proliferation rates of CAL27 cells in various groups detected by CCK -8 assay
表1　各组CAL27细胞中ROS 和MMP 水平
Tab Tab.. 1　CAL ROS and MMP levels in CAL2727  cells in various groups
groups                                                              (n =3,x ±s ,η/%)Group Control
Baicalein(µmol ·L －1
)
12.5    25.0    50.0
100.0  200.0
ROS 51.73±3.69
52.03±2.5562.93±1.55*64.87±2.06*74.33±3.14*90.63±1.18*
MMP 51.23±1.3844.87±2.04*35.07±1.95*32.23±2.07*23.20±1.85*18.87±5.95*
*
P <0.05 compared with control group.
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史乃旭， 等. 黄芩素对人舌鳞状细胞癌CAL27细胞增殖的抑制作用及其机制
芩素组CAL27细胞中S 期细胞百分率明显升高（P <0.05），G 0/G 1期细胞百分率明显降低（P <0.05），且呈浓度依赖性。见表2和图3。
2.4 各组CAL27细胞凋亡率 处理CAL27细胞48 h 后，与对照组比较，不同浓度黄芩素组细胞凋亡率呈浓度依赖性升高（P <0.05）。见表2和图4。
2.5 黄芩素与NAC 联合作用后各组CAL27细胞中ROS 水平 与对照组比较，50 μmol ·L －1
黄芩素组、100 μmol ·L －1黄芩素组、50 μmol ·L －1黄芩素+NAC 组和100 μmol ·L －1黄芩素+NAC
组细胞中ROS 水平明显升高（P <0.05），NAC 组细胞中ROS 水平明显降低（P <0.05）；分别与50和
100 μmol ·L －1 黄芩素组比较，50 μmol ·L －1黄芩素+NAC 组和100 μmol ·L －1
黄芩素+NAC 组细胞中ROS 水平明显降低（P <0.05）。见图5和表3。2.6 黄芩素与NAC 联合作用后各组CAL27细胞
MMP 水平 与对照组比较，50 μmol ·L
－1
黄芩素
组、100 μmol ·L －1黄芩素组和50 μmol ·L －1黄芩
素+NAC 组细胞MMP 水平明显降低（P <0.05），NAC 组和100 μmol ·L －1黄芩素+NAC 组细胞MMP 水平明显升高（P <0.05）；分别与50和100 μmol ·L －1黄芩素组比较，50 μmol ·L －1黄芩素+ NAC 组和100 μmol ·L －1黄芩素+NAC 组细胞MMP 水平明显升高（P <0.05）。见表3和图6。
表2　各组不同细胞周期 CAL27 细胞百分率和细胞凋亡率Tab Tab.. 2　CAL Percentages of CAL2727  c
ells at different cell cycles and apoptotic rates of  CAL and apoptotic rates of  CAL2727 cells in various groups  cells in various groups
(n =3,x ±s ,η/%)Group Control
Baicalein(µmol ·L －1)    50  100  200
Percentage CAL27 cells    S phase        G 0/G 1 phase 12.11±4.9217.81±7.55*18.94±6.31*22.38±6.05*
82.17±6.8274.97±11.07*73.78±10.75*71.04±8.62*
Apoptotic rate 0.80±0.2719.80±0.53*26.44±2.83*63.01±3.39*
*
P
<0.05 compared with control group.
A ： Control group ；
B ： 50 µmol ·L －1 baicalein group ；
C ： 100 µmol ·L －1 baicalein group ；
D ： 200 µmol ·L －1 baicalein group.
图3　流式细胞术检测各组不同细胞周期CAL27细胞百分率
Fig. 3　
Percentages of CAL27 cells at different cell cycles in various groups detected by flow cytometry
A ： Control group ；
B ： 50 µmol ·L －1 baicalein group ；
C ： 100 µmol ·L －1 baicalein group ；
D ： 200 µmol ·L －1 baicalein group.
图4　流式细胞术检测各组CAL27细胞凋亡率
Fig. 4　Apoptotic rates of CAL27 cells in various groups detected by flow cytometry
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