山东农业大学学报(自然科学版),2022,53(5):777-782VOL.53NO.52022 Journal of Shandong Agricultual University(Natural Science Edition)doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2022.05.017
不同品种大白菜自交不亲和强度与柱头ROS含量的关系
赵欢欢，张丽丽，黄家保，段巧红*
山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室，山东泰安271018
摘要：不同品种的大白菜其自交不亲和强度不同。前期发现，大白菜等十字花科蔬菜作物的自交不亲和是由柱头活性氧（ROS）调控的。本研究以大白菜强自交不亲和系′ZY15′及弱自交不亲和′6683′、′848′和′R16′为试材，比较了自交不亲和强度的不同与柱头ROS含量变化的关系。结果表明，具有强自交不亲和性的大白菜在自花授粉后，柱头ROS 升高更快、升高的幅度更大；用DPI克服强自交不亲和的大白菜更困难。本研究为进一步认识大白菜自交不亲和的调控机理、打破大白菜自交不亲和奠定基础。
关键词：大白菜；自交;ROS
中图法分类号:S634.1文献标识码:A文章编号:1000-2324(2022)05-0777-06
The Correlation between the Self-incompatibility Strength and Stigmatic ROS Changes in DifferentV arieties of Chinese Cabbages
ZHAO Huan-huan,ZHANG Li-li,HUANG Jia-bao,DUAN Qiao-hong*
College of Horticulture Science and Engineering//State Key Laboratory of Crop Biology,Shandong Agricultural University, Tai’an271018,China
Abstract:Different varieties of Chinese cabbages show different strength of self-incompatibility(SI).Previous study showed that SI in the Brassicaceae is regulated by stigmatic ROS.In this study,we compared the strength of SI and the change of stigmatic ROS after self-pollination in strong SI lines such as′ZY15′and weak SI lines such as′6683′,′848′,and′R16′.After self-pollination,stigmatic ROS increased faster and to a bigger extent in stronger SI Chinese cabbage.We also tested the extent of NADPH oxidase inhibitor,DPI,in reducing ROS and breaking down SI in different varieties of Chinese cabbage. Result showed that DPI is less effective to overcome SI of Chinese cabbage with strong SI.Our study laid a foundation for the breakdown of SI in different varieties of Chinese cabbage.
Keywords:Brassica rapa ssp.pekinensis;self-incompatibility;Reactive Oxygen Species
植物的花粉落到柱头上，开始吸水，萌发出花粉管，穿透花柱，最终进入胚囊，释放精细胞，完成双受精[1]。以上受精步骤，只要在某一个环节出现了障碍，就无法完成受精，都是自交不亲和（Self-incomp
atibility，SI）的表现。根据花器官形态有无差异，SI可分为异形自交不亲和性和同形自交不亲和性。同形自交不亲和性又可以分为配子体型自交不亲和性和孢子体型自交不亲和性[2,3]。大白菜（Brassica rapa ssp.pekinensis）是十字花科芸薹属（Brassica）植物，具有“干”柱头，属于孢子体型自交不亲和，花粉的行为由产生花粉的植株决定[2,3]。当自花的花粉落到柱头上，柱头乳突细胞有效地识别自花，阻止自花花粉水合及萌发[2,3]。
活性氧（ROS）作为重要的信号分子参与植物多个生物学过程[4-8]。很多种被子植物的柱头上积累大量ROS，特别是过氧化氢（H2O2）[9-12]。本课题组前期研究发现，柱头ROS在自花授粉后升高而在异花授粉后降低，且柱头ROS的升高对于抑制自花花粉生长是必需的[13]。本研究选用了自交不亲和强度不同的大白菜品种，发现自交不亲和强弱与自花授粉后柱头ROS升高的幅度成正比，而与用ROS合成抑制剂克服自交不亲和的难易程度成反比。本研究进一步解析了柱头通过其ROS含量调控自交不亲和的机理，同时也为十字花科蔬菜作物育种工作中克服自交不亲和性以提高自交繁种效率提供了指导意义。
收稿日期:2021-04-24修回日期:2021-06-18
基金项目：山东农业大学高层次人才引进启动经费
第1作者简介：赵欢欢(1994-)，男，硕士研究生，研究方向：蔬菜有性生殖.E-mail:*******************
*通讯作者:Author for correspondence.E-mail:***************
·778·山东农业大学学报(自然科学版)第53卷
1材料与方法
1.1材料
供试大白菜品种为自交不亲和系′ZY15′、′6683′、′R16-11′，由河南农科院提供，′848′商品种。试验于2017年2月到2018年3月在山东农业大学试验田进行。每隔15d种植一批材料，每个品种每次种植15棵，先用75%酒精、2.6%次氯酸钠杀菌消毒，时间各3min，然后将种子放在灭过菌的2mL 离心管中，加入1.5mL灭菌的ddH2O，45℃水浴2h，期间准备灭过菌的6cm滤纸及培养皿，将2张滤纸放到培养皿中后加入灭菌ddH2O，把滤纸全都浸湿，再将经过水浴处理的种子倒在滤纸上用镊子分散开来，做好标记放到23℃培养箱中黑暗条件放置2d左右，此时萌动出下胚轴，再将培养皿放到4℃低温光照培养箱中进行春化，′R16-11′，′848′的春化时间为15d，′6683′春化时间为20 d，′ZY15′春化时间为30d；春化完成后移到灭菌土里（土的配比为营养土：蛭石=3:1），经过60d，各个大白菜开花后进行试验。
1.2柱头活性氧染
柱头ROS染遵循课题组前期研究中使用的方法[13]。选择当天开放，并且花瓣开成正十字形的花朵，此时雄蕊低于雌蕊柱头，且花粉尚未散开，去雄。将柱头切下3mm后，在MES-KCl缓冲液（10mM MES，5μM KCl，50μM CaCl2，pH6.15）中浸泡30min，再用含有50
μM,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate（H2DCFDA）的MES-KCl缓冲液避光染1h。用MES-KC 缓冲液冲洗2遍，加入MES-KCl缓冲液浸泡15min，再重复1次，脱去背景。将样品取出置于载玻片上，使用MES-KCl缓冲液制片，在Nikon DS-Ri2显微镜下用绿荧光（Ex470-440,DM4951p, BA525/550）观察。
1.3实验材料的处理
在检测ROS抑制剂对柱头ROS及对授粉的影响时，在含不同浓度DPI的柱头培养基（5mM CaCl2,5mM KCl,0.01%H3BO3,1mM MgSO4·7H2O,10%sucrose,0.8%agarose,pH7.5）中体外培养6 h。处理完成后，授粉进行苯胺蓝染以观察花粉管生长，或进行ROS染。
1.4花粉管的观察
在检测ROS抑制观察花粉管遵循课题组前期研究中使用的方法[13]。将授粉6h的柱头用卡诺固定液（甲醇：乙酸=3:1）固定1h，在10M NaOH中于42℃软化30min，0.1%苯胺蓝染1h后显微镜下用紫外荧光（Ex375-328/DM415/BA351p）观察。
1.5亲和指数的计算
在大白菜盛花期时，选取花序进行套袋。刚要开的花，去雄，授自花花粉，套袋隔离。待种子成熟时，
统计结荚数、种子数量，计算亲和指数（结籽数/授粉花数）。
1.6数据处理与分析
使用Nikon DS-Ri2荧光显微镜观察，用image J进行数据测量，Photoshop2018作图。
2结果与分析
2.1不同品种大白菜花期亲和指数统计分析
首先比较不同品种大白菜花期与蕾期柱头的自交亲和性。在图1A中所示大白菜花序的花期与蕾期柱头进行自花授粉或异花授粉。结果如图1B所示，′ZY15′与′66-83′都表现出自花花粉管生长受抑制，异花花粉管却可以生长的典型的自交不亲和表型。在蕾期自交授粉20d后，′ZY15′和′6683′果荚均显著伸长（图1C）。而在花期自交授粉20d后表现出，′ZY15′果荚基本未发育，且出现发黄、皱缩甚至脱落的现象（图1D）。′6683′与′ZY15′相似，表现果荚大部分未发育且出现果荚发黄、皱
第5期赵欢欢等：不同品种大白菜自交不亲和强度与柱头ROS含量的关系·779·缩甚至掉落的现象，但是少数果荚表现出胚珠膨大（图1D）。
图1不同品种大白菜自交果荚表型
Fig.1Self-or cross-pollinated Chinese cabbage pistils
A：大白菜花序；B：自交异交授粉苯胺蓝对比，标尺500μm；C,D：蕾期、花期自花授粉20d后果荚发育表型。标尺=1cm,**P<0.01，T检验。
A:An image of Chinese cabbage inflorescence;B:Aniline Blue staining of pistils after self-or cross-pollination,scale bar=500μm;C,D: Image of pods at20days after self-pollination at bud and flower stage.Scale bar=1cm,**P<0.01,T test.
我们进而比较了′ZY15′、′6683′、′848′、′R16-11′的花期自交亲和指数，结果如表1所示，′ZY15′的花期亲和指数只有0.35，也就是1个果荚内平均有0.35粒种子，而′6683′的亲和指数为0.94，一个果荚内平均有0.94粒种子。这说明′ZY15′是强自交不亲和系，而′6683′是弱自交不亲和系。另两个白菜品种，′848′与′R16-11′的花期亲和指数分别是0.42和0.55，表明这两个品种的自交不亲和强度比较接近。
表1不同品种的大白菜花期亲和指数统计
Table1Statistics on anthesis compatibility index of different varieties of Chinese cabbage
品种
Variety′R16-11′′ZY15′′848′′6683′花期亲和指数
Compatibility index0.55±0.07**0.35±0.03**0.42±0.08**0.94±0.1**
*每列中字母相同者表示差异未达显著水平（P>0.05），字母不同者表示差异达显著水平（P<0.05）。
The same alphabets in right side of the same list show no significance（P>0.05）,on the contrary,having significant difference（P<0.05）.
2.2异花授粉和自花授粉对大白菜柱头ROS的影响
图2大白菜自交与异交活性氧染
Fig.2Stigmatic ROS changes after self-or cross-pollination
标尺=500μm。**P<0.01，T检验。Scale bar=500μm，**P<0.01,T test.
·780·山东农业大学学报(自然科学版)第53卷ROS作为信号分子可以参与植物细胞多种不同的生物学过程[10-12]。在相同条件下，分别对′ZY15′
柱头进行异花授粉和自花授粉。结果如图2所示，当′ZY15′异花授粉3min时，柱头ROS显著降低，比未授粉柱头下降了33%；在授粉后10min时，柱头ROS进一步下降，比未授粉柱头下降了60%。当′ZY15′自花授粉3min时，柱头ROS显著升高，比未授粉柱头升高了20%；而在授粉后10min时，柱头ROS进一步升高，比未授粉柱头升高了53%。这表明，柱头ROS是由自花授粉及异花授粉特异性调控的。
2.3自交不亲和强度不同的大白菜自交后柱头ROS变化的差异
为了检测自交不亲和强度的不同是否与柱头ROS的变化有关联，我们分别检测了强自交不亲和系′ZY15′与弱自交不亲和系′6683′花期柱头ROS在自花授粉1min之后的变化。结果如图3所示，未授粉时，′ZY15′柱头ROS荧光强度为15左右，′6683′柱头ROS相对荧光强度为18左右，二者柱头ROS初始水平基本相同。授粉1min后，′ZY15′柱头ROS荧光强度为38左右，和初始水平相比有显著性差异。而′6683′柱头RO
S相对荧光强度为21左右，和初始水平相比无显著性差异（图3）。结果表明，对于自交不亲和大白菜来说，自交不亲和性越强，柱头ROS变化幅度越高，升高越快。
图3自交不亲和强度不同的大白菜自花授粉1min后柱头ROS变化
Fig.3Stigmatic ROS changes in stigma of different strength of SI at1min after self-pollination
2.4抑制ROS产生的试剂，DPI，对大白菜柱头ROS的影响
NADPH氧化酶在植物中也称之为呼吸迸发氧化酶(respiratory burst oxidase homologs，Rboh)，NADPH氧化酶可能是应激条件下ROS产生和积累的主要ROS合成酶[7,8]。Diphenyleneiodonium chloride（DPI）是一个广泛的黄素蛋白抑制剂，可以有效的抑制NADPH氧化酶的活性，降低ROS 含量[6]。大白菜′R16-11′柱头经DPI处理后，随着DPI浓度的提高，大白菜柱头ROS含量逐渐降低（图4）。未授粉柱头ROS荧光强度为20左右，而用100μM DPI处理后，ROS荧光强度为5左右，相对初始水平下降60%；DPI浓度1000μM时，ROS相对荧光强度为2.5左右，相对初始水平下降87.5%，具有极显著性差异。这表明DPI可以有效的降低大白菜柱头ROS的含量。
图4DPI处理′R16-11′花期未授粉柱头ROS变化情况
Fig.4Changes of ROS of in unpollinated′R16-11′stigmas treated with DPI
第5期赵欢欢等：不同品种大白菜自交不亲和强度与柱头ROS含量的关系·781·
2.5DPI克服不同品种大白菜的自交不亲和
我们进而用1mM DPI处理柱头，以检测对不同品种大白菜自交不亲和性的影响。对于强自交不亲和大白菜′ZY15′，花粉粒无法粘附在未处理的柱头上；而经过DPI处理的柱头，花粉粒可以黏附在柱头上，有花粉管穿透柱头乳突细胞，两种白菜均表现出一定的亲和性（图5）。但亲和性的变化程度存在显著性差异，′ZY15′柱头经DPI处理后，有35%的柱头有花粉管穿过柱头乳突细胞，其中15%柱头有多于30根花粉管穿过。而′6683′柱头经DPI处理后，60%的柱头有花粉管穿过柱头乳突细胞，其中40%柱头有多于30根花粉管穿过；（图5）。这表明，DPI可以克服不同品种大白菜的自交不亲和性，但是自交不亲和强度不同的大白菜对DPI的敏感程度不同。自交不亲和强度越高，对DPI越不敏感，越难克服。
图5DPI对自交不亲和强度不同的大白菜的影响
Fig.5The effect of DPI on Chinese cabbages with different strength of SI
Bar=500µm,**P<0.01.
为了进一步验证DPI克服自交不亲和与大白菜本身的自交不亲和强度的关系，我们检测了DPI 对′R16-11′与′848′这两种自交不亲和强度基本相同的大白菜的影响。当′R16-11′用DPI处理后，有50%的柱头有花粉管穿过柱头乳突细胞，其中20%柱头有多于30根花粉管穿过；′848′柱头经DPI处理后，有40%的柱头有花粉管穿过柱头乳突细胞，其中9%柱头有多于30根花粉管穿过（图6），与DPI 对′R16-11′自交不亲和的克服程度相似。这表明，DPI克服大白菜自交不亲和，确实与大白菜柱头本身的自交不亲和强度密切相关。
图6DPI对自交不亲和强度相似的大白菜的影响
Fig.6The effect of DPI on Chinese cabbages with similar strength of SI
3讨论
大白菜等十字花科蔬菜作物常利用自交不亲和系育种。为了提高杂交种纯度，杂交亲本的自交不亲和性越高越好，但是强自交不亲和系往往自交繁种困难，这样就限制了强自交不亲和系作为杂交亲本的使用。因此，如何调控十字花科蔬菜作物的自交不亲和，一直是亟待解决的难题。本课题组前期研究发现，柱头ROS在自花授粉后升高而在异花授粉后降低，且柱头ROS的升高对于抑制自花花粉生长是必需的[13]。
reactive oxygen species (ros)
而本研究通过对大白菜自交不亲和强弱不同与柱头ROS差异的分析，探讨了活性氧含量与自交

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