低温对斑马鱼ZF4细胞基因组DNA甲基化水平的影响
侯艳雯;刘玮;姜蓬垒;张俊芳;韩兵社
【摘 要】低温压力会导致鱼类生理功能失调、机体损伤甚至死亡,鱼类会产生各种适应性变化来应对低温压力,其中涉及的表观遗传学机制越来越受到重视.为了探讨鱼类低温应激压力下的表观遗传学调控机制,本研究对斑马鱼(Danio rerio)胚胎成纤维细胞ZF4进行短期低温胁迫(18℃处理3 d、5 d和10℃处理3 d、5 d)和长期低温胁迫(18℃处理30 d),然后用具有不同甲基化敏感性的同裂酶HpaⅡ和MspⅠ对细胞基因组DNA进行酶切以监测细胞基因组DNA甲基化水平变化.结果显示短期低温胁迫下ZF4细胞生长受到抑制甚至死亡,而经过长期低温胁迫的ZF4细胞对低温压力产生了一定适应性.并且低温胁迫下DNA甲基化水平呈现动态变化,短期低温培养细胞的基因组DNA甲基化水平明显增高,但是长期低温培养细胞的DNA甲基化水平反而下降.此外,研究发现抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)或者共济失调-毛细血管扩张突变蛋白(ataxia telangiectasia mutated,ATM)抑制剂KU-55933可以抑制18℃5 d低温处理后的ZF4细胞DNA甲基化水平的增高,说明活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生和ATM的激活介导了DNA甲基化水平的增高.本研究结果显示,短期低温刺激下ZF4细胞ROS的产生导致DNA损伤,激
活DNA损伤修复机制,进而导致基因组DNA甲基化水平上升,该研究为后期斑马鱼低温胁迫分子机制的研究奠定基础.
【期刊名称】《中国水产科学》
【年(卷),期】2019(026)002
【总页数】9页(P271-279)
【关键词】斑马鱼ZF4细胞;低温应激;ROS;ATM;DNA甲基化
【作 者】侯艳雯;刘玮;姜蓬垒;张俊芳;韩兵社
【作者单位】水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海海洋大学, 上海 201306;水产科学国家级实验教学示范中心, 上海海洋大学, 上海 201306;海洋生物科学国际联合研究中心, 中国科学技术部, 上海海洋大学, 上海 201306
【正文语种】中 文
【中图分类】S917
DNA甲基化是发生于DNA胞嘧啶第五个碳原子上的一种共价修饰, 作为一种表观遗传标记, DNA甲基化已经被证明与基因组功能、基因转录以及X染体失活相关[1-2]。在脊椎动物中, DNA甲基化主要发生在鸟嘌呤前的胞嘧啶位点上或者在CpG岛上, 研究发现在人类和小鼠胚胎干细胞中, DNA非CpG岛区域也存在甲基化修饰, 然而这种非CpG位点的甲基化在成熟组织中往往会被丢失[3]。越来越多的研究发现环境压力能够改变基因组甲基化水平, 如磷饥饿[4]以及热压力[5]。  在植物中, DNA甲基化调控胁迫应答基因的表达使植物适应外界环境变化[6-7], 在昆虫中研究发现, DNA甲基化的改变使得昆虫适应温度的变化[8]。然而, 在鱼类中DNA甲基化与冷适应之间的关系尚未研究清楚。
活性氧(reactive oxygen species, ROS)如超氧阴离子(O2–)和过氧化氢(H2O2)等, 是需氧细胞在代谢中产生的电子还原产物。在高浓度时, ROS很容易与蛋白质、脂类、碳水化合物以及核苷酸反应, 这些反应通常包括不可逆的功能的改变, 甚至是彻底的破坏[9]。已有研究证明, 短期低温压力下斑马鱼ZF4细胞中ROS水平明显上升并且产生DNA双链断裂[10]。在植物中研究发现, 低温压力下ROS作为一种信号分子能激活细胞转录调控从而调控下游基因的表达, 最终使得植物适应低温[11]。在人结肠癌细胞中研究发现ROS能在启动子CpG岛产生氧化损伤, 损伤部位能够募集DNA甲基转移酶1(DNMT1)等表观酶类[12], 导致DNA发生甲基化, 从
而抑制下游基因的转录[13]。ATM是应答DNA双链断裂的一个重要的调控因子, 控制着一个复杂的生化网络, 能够直接或间接影响DNA损伤修复[14]。研究证明ROS能够激活共济失调–毛细血管扩张症突变蛋白(ataxia- telangiectasia mutated, ATM)[15]。但是活性氧导致的氧化损伤与低温鱼类细胞甲基化水平改变是否有关尚不明确。reactive oxygen species (ros)
斑马鱼(Danio rerio)由于易饲养、繁殖速度快且基因组全序列已经公布成为一种广泛应用于分子生物学、遗传学的模式生物[16]。斑马鱼成纤维细胞ZF4细胞系是来源于发育1 d的斑马鱼胚胎, 常用于研究硬骨鱼类冷适应过程中基因表达调控[17]以及甲基化水平变化[18]。本研究探究了不同时间点(3 d、5 d和30 d), 和不同温度条件下(18℃和10℃), 斑马鱼ZF4细胞DNA甲基化水平变化及其与低温下氧化损伤之间的关系, 为后期斑马鱼细胞低温胁迫分子机制的研究奠定基础。
斑马鱼胚胎成纤维细胞ZF4购于American Type Culture Collection (ATCC), 采用DMEM/F- 12培养基[(含2.50 mmol/L谷氨酰胺(Hyclone), 青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 mg/mL)(Hyclone)、10%的胎牛血清(Gibco)], 于28℃、95%湿度、5%CO2的培养箱中进行培养。每隔2 d换液, 当细胞长至90%用不含有EDTA的0.25%胰蛋白酶(Gibco)进行消化, 1 : 2传代后加入培养基继续培养, 实验所用的细胞均为4~6代。
DMEM/F-12液体培养基(Hyclone, SH30023.01B)、胎牛血清和胰蛋白酶购于Gibco 公司; 谷氨酰胺L-glutamine (Hyclone, SH30034.01)和杜氏磷酸缓冲液DPBS购于Thermo公司; KU- 55933和二甲基亚砜DMSO购于Sigma公司; 限制性内切酶MspⅠ和HpaⅡ购于NEB公司; 甲基化检测试剂盒5-mC DNA ELISA Kit (D5325)购于Zymo Research公司; 其他常用试剂均为国产分析纯。
主要仪器: 倒置荧光显微镜(Zeiss)、细胞低温培养箱(Galaxy170R, Eppendorf)、多功能酶标仪(BioTek)、电泳仪(Bio-Rad)。
1.3.1  细胞低温处理  取生长状态良好的野生型ZF4细胞, 实验前1 d按汇合度70%接种于100 mm培养皿中, 28℃培养24 h后, 将细胞放到低温培养箱中, 18℃低温培养3 d、5 d、30 d, 10℃低温培养3 d、5 d。利用倒置显微镜观察细胞形态并拍照。
1.3.2  N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理细胞  取对数期ZF4细胞提前1 d接种至100 mm培养皿中,  28℃培养24 h, 待汇合度至70%~90%, 加入终浓度2 mmol/L的NAC于28℃预处理2 h后放到低温培养箱, 18℃处理3 d、5 d, 每天都需要补充NAC。
1.3.3  KU-55933处理细胞  取对数期ZF4细胞提前1 d接种至100 mm培养皿中, 28℃培养24 h, 待汇合度至70%~90%, 参照Chwastek等[19]的研究结果, 选取终浓度为1 μmol/L和10 μmol/L的KU-55933于28℃预处理1 h后放到低温培  养箱18℃处理3 d、5 d, 每天都需要补充KU- 55933。
28℃培养的细胞分为两组, 接种于12孔板中, 24 h后一组置于28℃培养作为常温对照组, 另一组置于18℃培养7 d作为18℃短期培养组; 另外将18℃低温驯化30 d的细胞也接种至12孔板中, 24 h后置于18℃培养箱中培养7 d作为18℃长期培养组。每天将细胞用胰酶消化收集, 用磷酸缓冲液(PBS)稀释至适当浓度, 加入0.4%(wt/v)台盼蓝进行活细胞染, 吹打均匀后用血球计数板进行计数。
利用两种限制性内切酶MspⅠ和HpaⅡ对基因组DNA进行酶切, MspⅠ和HpaⅡDNA识别位点都是CCGG, 但是具有不同的甲基化敏感性: HpaⅡ不能对发生甲基化的DNA进行酶切而MspⅠ可以。用酚氯仿法提取出细胞基因组DNA,  取1 μg基因组DNA, 分别用MspⅠ和HpaⅡ于37℃水浴锅中酶切过夜。酶切后的DNA用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳分析。利用灰度分析软件, 通过比较HpaⅡ/MspⅠ的比值分析各个样品间的相对甲基化水平[20]。
利用酚氯仿法提取细胞基因组DNA, 后按照Zymo Research公司的5-mC DNA ELISA 试剂盒(5-mC DNA ELISA Kit, D5325, Zymo Research)说明书检测基因组DNA甲基化水平。
比生长速率(μ)通过以下公式计算:
其中, Cv为活细胞密度(106 cells/mL), t为培养时间(day)。
所有实验结果均是来自至少3次独立实验, 图中所示结果均为均值±标准差(±SD)。t-test法用于检测低温处理的显著性, 两两之间的显著差异(P<0.05)利用Turkey’s多重比较来检测。
用倒置相差显微镜观察细胞可以发现, 在正常培养温度下(28℃)ZF4细胞呈不规则三角形, 细胞核为卵圆形, 胞质突起, 细胞边缘清晰。在18℃低温处理5 d后, 细胞形态无显著变化, 有少量细胞脱落。在18℃低温处理30 d后, 可以看见细胞边缘模糊, 大部分细胞不再是不规则三角形, 细胞核形态不规则。在10℃处理处理3 d后, ZF4细胞形状从不规则三角形收缩为长条状, 细胞间空隙变大, 部分细胞死亡。而在10℃处理5 d后, 细胞大量死亡漂浮在培养基中(图1a)。
对低温18℃下细胞进行比生长速率测定发现, 28℃细胞以及18℃下处理30 d的细胞在接种后4~5 d都能达到最大比生长速率, 分别为0.568和0.355。而18℃下短期处理的细胞贴壁后第1
天有部分细胞死亡, 比生长速率为负, 之后的第2~7天比生长速率也较低, 在0.06左右。并且从图中可以看出, 相同时间点下, 18℃长期培养的细胞的比生长速率显著高于18℃短期培养组(P<0.05) (图1b)。
与28℃下培养的细胞相比, 无论是在18℃还是10℃, 短期低温压力都能导致细胞基因组甲基化水平上升, 而在18℃低温处理30 d后, 细胞基因组甲基化水平明显下降(P<0.05)(图2a、图2b)。用5-mC DNA ELISA试剂盒检测同样证明相比于对照组(28℃), 18℃处理5 d细胞其DNA甲基化水平上升而18℃处理30 d细胞的DNA甲基化水平下降(图2c)。

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