褪黑素在卵母细胞发育中的作用及体外成熟培养中的应用
刘婷婷;章志国
【摘 要】褪黑素是一种广谱抗氧化剂,不仅可以通过与特异性受体结合产生一系列的生物学效应,而且可以直接穿过生物细胞膜进入细胞内,清除细胞内活性氧簇,降低氧化应激反应.另有研究证实,褪黑素可通过其抗氧化作用促进卵母细胞发育成熟,提高卵母细胞的发育潜力.近年来,褪黑素抗氧化作用逐渐成为研究的重点.然而在体外成熟培养(in vitro maturation,IVM)的培养基中添加褪黑素促进卵母细胞成熟,提高卵母细胞的发育潜力的机制还不清楚.综述褪黑素在卵母细胞发育中的作用及在卵母细胞IVM中的应用.
【期刊名称】《国际生殖健康/计划生育杂志》
【年(卷),期】2014(033)005
【总页数】4页(P375-378)
【关键词】细胞,培养的;生殖技术,辅助;活性氧;褪黑素;人未成熟卵母细胞;体外成熟培养
【作 者】刘婷婷;章志国
【作者单位】230022合肥,安徽医科大学第一附属医院生殖中心;230022合肥,安徽医科大学第一附属医院生殖中心
【正文语种】中 文
人未成熟卵母细胞体外成熟培养（in vitro maturation，IVM）是人类辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）的重要组成部分，常作为多囊卵巢综合征（polycysticovarysyndrome，PCOS）、卵巢早衰以及某些肿瘤患者等的主要助孕手段［1］。但与常规体外受精（in vitro fertilization，IVF）相比，IVM的妊娠率仍处于较低的水平，限制了IVM技术的常规应用。迄今为止，世界范围内仍没有广泛认可的IVM方案，其主要原因为人未成熟卵母细胞在IVM过程中易受到氧化应激的作用，影响了卵母细胞的正常发育［2］。因此，降低IVM过程中的氧化应激反应是优化IVM技术的突破点之一。褪黑素（N-乙酰基-5-甲氧基胺）作为一种广谱抗氧化剂，不仅可以通过与特异性受体结合产生一系列的生物学效应，而且可以直接穿过生物细胞膜进入胞内，清除胞内活性氧簇（reactiveoxygen species，ROS），因此卵泡液中褪黑素的存在可以抑制卵母细胞生长发
育过程中的氧化应激反应，促进卵母细胞的发育成熟。本文详细阐述了褪黑素在卵母细胞IVM中的应用。reactive oxygen species (ros)
细胞内的生物化学反应和外界的高氧环境均会产生ROS，包括超氧根（O2·-）、羟自由基（·OH）和过氧化氢（H2O2）等。ROS作为氧化还原反应的信号分子，主要通过调节细胞内代谢产物和信号转导通路影响细胞的功能［3-4］，一方面可促进某些正常的生理活动，另一方面细胞内过多的ROS可作用于脂质、蛋白质和核酸，导致细胞膜完整性缺失、蛋白质结构和功能改变以及核酸的损伤［5］。
卵泡液中存在一定量的ROS，对卵泡的发育、卵子成熟及排卵均发挥重要的生理作用［6］。但是过量的ROS会诱发氧化应激反应，影响卵子和颗粒细胞的发育，并加速卵子老化，降低卵子质量［7］。由于卵母细胞从未成熟的生发泡期（GV期）发育至成熟的第二次减数分裂中期（MⅡ期）需要消耗大量的三磷酸腺苷（ATP）［8］，而过量的ROS会损伤线粒体、抑制ATP合成酶的活性，导致卵子内ATP减少，影响卵子发育过程的能量供给，导致卵子质量下降［9］。在卵子和胚胎的体外培养过程中，卵子或胚胎暴露于光、高浓度氧以及代谢产物中，可加剧氧化应激的发生，影响卵子或胚胎质量［2］。因此，在IVM或胚胎培养基中添加抗氧化剂成分抑制氧化应激可能是优化和改善IVM技术的重要措施之一。
氧化应激反应是一种氧化剂（氧自由基与氮氧化物）与抗氧化剂失衡的状态。抗氧化剂可通过清除过量的ROS抑制体内的氧化应激反应，主要包括酶型抗氧化剂和非酶型抗氧化剂。酶型抗氧化剂主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、过氧化氢酶（CAT）；非酶型抗氧化剂主要包括维生素C、维生素E、谷胱甘肽（GSH）、尿酸和白蛋白［7］。Tatemoto等［10］发现，猪卵泡液中含有抗氧化剂SOD，在IVM培养基中加入猪卵泡液可以减少由氧化应激导致的细胞损伤，提高卵子的发育潜能。因此，维持氧化剂/抗氧化剂之间的平衡，对卵子成熟及其质量至关重要。
褪黑素由松果体分泌，作用于下丘脑-垂体上其特异性受体，调节促性腺激素的释放，影响卵巢和生殖功能。褪黑素的分泌与24 h光线变化同步，其合成受光线强弱控制，感光信号由视网膜产生，经过多神经通路到达松果体，其中去甲肾上腺素对褪黑素的合成起重要作用［11］。血清中褪黑素浓度在白天降低，夜晚显著升高，可调节人体的昼夜节律［12］。褪黑素合成的过程是松果体细胞从血液中摄取L-氨酸，其在松果体细胞中催化为5-羟胺，5-羟胺脱羧形成血清素。芳基胺乙酰基转移酶（AANAT）催化血清素乙酰化形成N-乙酰羟胺。形成褪黑素的最后一步反应是羟基吲哚-O-甲基转移酶（HIOMT或ASMT）甲基化N-乙酰羟胺，形成褪黑素，见图1。
褪黑素合成后快速释放到血液，随后转至各种体液中。褪黑素的特异性受体1（melatonin receptor1，MT1）和MT2广泛分布于人体的组织细胞中，与褪黑素结合后被激活，一方面可减少cAMP的形成、降低蛋白激酶A活性以及cAMP反应元件的磷酸化，另一方面，通过调节丝裂原活化蛋白激酶激酶1（MEK1）和MEK2、细胞外信号调节激酶1（ERK1）和ERK2以及蛋白激酶C等的磷酸化影响细胞内某些信号转导通路［13］。
褪黑素可结合·OH、次氯酸（HOCl）、H2O2等活性氧，还能与氧化氮基（NO·）及过氧亚硝酸根（ONOO-）等结合，是一种广谱抗氧化剂［14］。褪黑素同时具备亲脂和亲水两种特性，因此能顺利进入组织细胞的线粒体和细胞核内以及体液中。此外，褪黑素及其代谢产物能够激活一些抗氧化酶如SOD、GPx和CAT等［15］，发挥直接清除和间接清除ROS的功效。2012年Gao等［16］在冻融后小鼠胚胎的培养过程中添加褪黑素，发现胚胎细胞内的GSH浓度高于对照组。Tamura等［17］证实H2O2可阻止小鼠卵子成熟，而褪黑素可以降低卵胞浆内H2O2的水平。此外，褪黑素还可以有效地减少氧化应激引起的染体和线粒体DNA的损伤，起到抑制细胞凋亡的作用。
大量研究证实，褪黑素通过其较强的抗氧化能力在卵母细胞成熟和胚胎发育过程中发挥重要
作用。在培养基中添加10-9mol/L的褪黑素可显著提高猪卵母细胞的成熟率，增加孤雌囊胚数［18］，在牛胚胎培养基中添加褪黑素可抑制自由基的形成，促进胚胎发育［19］。此外，添加褪黑素有利于2-细胞鼠胚的体外培养，可促进囊胚形成，获得更多的早期囊胚和孵化囊胚［20］。
有研究发现，卵泡液中褪黑素的浓度显著高于外周血，并且大卵泡（卵泡发育后期）液中的褪黑素浓度高于小卵泡（卵泡发育早期）液中，提示褪黑素在卵母细胞的发育和成熟过程中起重要作用［21］。另有研究证实，褪黑素可以通过与颗粒细胞上特异性受体结合，激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），调节颗粒细胞上黄体生成激素（LH）受体和促性腺激素释放激素受体基因的表达和卵巢功能［22］。Kang等［23］通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术证实，MT1基因在猪的卵丘细胞和颗粒细胞中表达，并不在卵子中表达。El-Raey等［24］也发现牛卵丘细胞复合物表达HIOMT，提示褪黑素的生物合成可能发生在卵丘复合物中。
上述研究表明，褪黑素可通过与颗粒细胞或者卵子上的特异性受体结合以及作为抗氧化剂而发挥其促进卵母细胞成熟的生理作用，但其机制尚不清楚，仍需更深入的研究。
动物实验中，IVM培养基中加入一定浓度的褪黑素可以促进卵子的成熟，提高囊胚形成率，增加囊胚的细胞数目和囊胚的孵出率。猪卵泡液中褪黑素的浓度约为10-11mol/L，且褪黑素在小卵泡（直径＜3mm）中的浓度高于大卵泡（直径≥3mm），与人卵泡液中的测量结果正好相反。Shi等［18］在IVM培养基中添加不同浓度的褪黑素（10-11，10-9，10-7，10-5，10-3mol/L）后发现，褪黑素浓度为10-9mol/L时卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数高于其他组；在胚胎培养基中添加褪黑素浓度为10-7mol/L时卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数最高，而在IVM和胚胎培养基中均加入浓度为10-9mol/L褪黑素时，卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数均高于在IVM培养基和胚胎培养基中单独添加者。2009年Kang等［23］的研究也证实，在IVM培养基中加入0.043μmol/L褪黑素后，猪未成熟卵母细胞排出第一极体的卵子比例增加，孤雌囊胚比例也增加，但卵裂率和囊胚的内细胞团细胞数并无显著变化。
随着对褪黑素研究的不断深入，褪黑素在人类未成熟卵母细胞IVM中的应用研究价值也受到更多的关注。2013年Wei等［1］发现，在IVM培养基中添加低浓度的褪黑素可以促进卵子的成熟，培养基中添加1 nmol/L的褪黑素，卵子核成熟率高于其他组，而褪黑素浓度过高（106nmol/L）时卵子的核成熟率则出现明显下降趋势。Kim等［25］则发现常规IVF患者成熟卵泡液中褪黑素的生理浓度［（0.589±0.112）nmol/L］高于PCOS患者［（0.090±0.015）
nmol/L］，含20%人卵泡液的IVM基础培养基中［褪黑素浓度为（0.066± 0.020）nmol/L］，分别培养5枚卵丘混合物和不含颗粒细胞的卵子，24 h后两者的褪黑素浓度分别为（0.282±0.089）nmol/L和（0.063±0.017）nmol/L，证实在卵母细胞生长发育过程中，颗粒细胞能够合成褪黑素。此外，该研究还对部分PCOS患者进行了IVM，将患者未成熟卵母细胞分别放入含10μmol/L褪黑素的IVM培养基和未添加褪黑素的IVM培养基中进行培养，结果显示添加褪黑素组卵母细胞的成熟率、受精率、卵裂率以及胚胎发育状况虽与未添加褪黑素组相近，但胚胎移植率和妊娠率均高于未添加褪黑素组。
鉴于IVM的成功率仍低于IVF周期，因此探索安全、高效的IVM技术将有助于改善PCOS及卵巢反应不良患者的效果。氧化应激反应是影响卵子质量最重要的因素之一，降低卵子及卵泡液中自由基浓度是获取高质量卵子的关键。褪黑素作为广谱抗氧化剂，具有亲脂性和亲水性，允许褪黑素通过各种生物膜发挥其抗氧化剂作用，减少细胞内的自由基。并可通过与特异性受体（MT1和MT2）结合，激活多条细胞信号通路，调节孕激素的产生及颗粒细胞上LH受体和促性腺激素释放激素受体的基因表达。已有研究表明IVM培养基中加入低浓度的褪黑素，可以改善卵子的质量，获取更多的优质胚胎，但尚缺乏大样本的随机对照研究，且褪黑素是否会对卵子的染体产生负面影响仍需进一步研究证实。
【相关文献】
［1］Wei D，Zhang C，Xie J，et al.Supplementation with low concentrations ofmelatonin improves nuclearmaturation of human oocytes in vitro［J］.JAssistReprod Genet，2013，30（7）：933-938.
［2］CombellesCM，Gupta S，AgarwalA.Could oxidativestress influence the in-vitro maturation of oocytes?［J］.Reprod Biomed Online，2009，18（6）：864-880.
［3］Ferro E，Goitre L，BaldiniE，etal.RasGTPases areboth regulators and effectorsof redox agents［J］.MethodsMolBiol，2014，1120：55-74.
［4］Mailloux RJ，Jin X，WillmoreWG.Redox regulation ofmitochondrial functionwith emphasison cysteine oxidation reactions［J］.Redox Biol，2013，2：123-139.

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