诱导酵母细胞凋亡中SOD1和SOD2基因的作用

      细胞生物学论文第三篇：诱导酵母细胞凋亡中SOD1和SOD2基因的作用


      摘要：为了探讨SOD1和SOD2基因在诱导酵母细胞凋亡中的作用，本实验以酿酒酵母野生株BY4741（WT）及其突变体Δsod1和Δsod2为材料，研究了对酵母细胞生长和相对存活率的影响，以及酵母细胞在胁迫下活性氧（Reactive oxygen species, ROS）水平、线粒体膜电位和细胞凋亡率的变化。结果显示，可抑制酵母细胞生长，诱导胞内ROS水平和细胞凋亡率升高。在相同砷处理组中，Δsod1相对存活率、细胞胞内ROS水平和细胞凋亡率显著高于野生株，线粒体膜电位显著低于野生株；Δsod2细胞凋亡率显著高于野生株。结果表明，诱导的酵母细胞凋亡与胞内ROS水平的升高有关，而超氧化物歧化酶基因与引起的细胞凋亡密切相关。


reactive oxygen species (ros)      关键词：; 酵母; 凋亡; 超氧化物歧化酶; 活性氧;


      Effects of SOD1 and SOD2 Gene Deletions on Arsenic-induced Apoptosis in Yeast Cells


      WU Lihua YI Huilan CHEN Yanfei QIAO Hongping ZHAO Wenjing


      Department of Biology, Taiyuan Normal University School of Life Science, Shanxi University


      Abstract：To explore the role of SOD1 and SOD2 in sodium arsenite-induced apoptosis
in yeast cells, yeast wild-type (BY4741), SOD1 mutant (Δsod1) and SOD2 (Δsod2) mutant strains were used to study the effects of sodium arsenite on the growth and relative survival rate in the yeast cells. In addition, intracellular reactive oxygen species (ROS) level, mitochondrial membrane potential and apoptotic rate of the yeast cells under sodium arsenite-induced stress were determined in this study. The results showed that sodium arsenite induces growth inhibition and cell apoptosis in yeast cells with increased intracellular ROS levels. In the same treatment group, relative growth and clonogenic survival rate were lower, meanwhile, apoptosis rate and intracellular ROS levels were higher significantly in the yeast strain lacking SOD1 (Δsod1) compared to the WT strain, but no significant difference except for apoptosis rate was observed between in Δsod2 and WT strains. These results indicated that sodium arsenite- induced yeast apoptosis was associated with increased intracellular ROS level, and superoxide dismutase is essential in sodium arsenite- induced yeast apoptosis.


      0 引 言


      凋亡，是一种由基因严格控制的程序性细胞死亡方式，在调控机体生长发育和对外界刺激的反应等生物学过程中起重要作用。现有研究表明，细胞凋亡的异常可增加多种疾病的发病率，如神经退行性疾病、中风，甚至癌症等。因此，细胞凋亡成为近年来整个生命科学领域关注的研究热点。


      砷是一种广泛分布于自然界中的有毒元素，可以通过皮肤、消化道、呼吸道等多种途径进入人体，并可对人体健康造成严重威胁【2】。大量研究显示，长期或急性接触砷可破坏机体原有的氧化/还原平衡，诱导生物体内活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的产生。当体内大量ROS无法被及时清除时，即可引起细胞死亡或凋亡。


      超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是生物体内重要的抗氧化酶之一。在模式生物酵母细胞中，SOD主要包括分布于细胞质和线粒体膜间隙的CnZnSOD（SOD1）和分布于线粒体基质内的MnSOD（SOD2）。前期研究表明，高浓度砷可改变酵母细胞SOD及其它抗氧化酶活性，引起细胞氧化损伤，诱导细胞死亡或凋亡，但SOD1和SOD2基因在砷诱导酵母细胞凋亡中的作用机制尚不清楚。因此，本实验选用酵母野生株BY4741和其突变体?sod1，?sod2为研究材料，研究SOD1和SOD2基因缺失对诱导酵母细胞凋亡的影响，以期为砷的毒性机理提供实验依据。


      1 材料和方法


      1.1 菌株


      酿酒酵母BY4741（MATa his 3?1 leu2?0 met15?0 ura3?0，WT）及其突变体 ?sod1和?sod2，均购自Invitrogen公司。


      1.2 材料培养


      挑取酵母细胞单菌落接种于YPD（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）液体培养基中（1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖），28 ℃，180 r/min恒温震荡培养至对数期后用于毒性处理。固体培养基中需加入1.5~2%的琼脂粉。


      1.3 细胞生长测定


      取适量对数期细胞接种于含有不同浓度（0~2 mmol/L）的液体培养基中（每个样本初始OD600一致），28 ℃，180 r/min恒温震荡培养，每隔2 h取适量培养液测其OD600，绘制生长曲线；以野生株酵母（WT）培养24 h后的OD600为对照，计算相对生长率（OD600处理组/OD600野生株对照组x100%）。收集所有菌株培养24 h后对照组和1 mmol/L处理组细胞，检测胞内ROS水平、线粒体膜电位和细胞凋亡率。


      1.4 细胞存活率测定


      参照Zheng等实验方法，将适量对数期细胞涂布至含有不同浓度的平板上，每个平板含有细胞数约200个，28 ℃恒温倒置培养48 h后观察计数单菌落数，并计算细胞相对存活率（处理组单菌落数/对照组单菌落数x100%）。每个处理组至少3个重复。


      1.5 细胞凋亡率、胞内ROS和线粒体膜电位测定


      将用PBS洗涤后的酵母细胞用适量Annexin Ⅴ-FITC结合液重悬后加入Annexin Ⅴ-FITC和Propidium Iodide（碘化丙啶，PI）染液；或分别悬浮于一定浓度的2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate（DCFH-DA，ROS荧光探针）和Rhodamine 123（Rho123，罗丹明123）中，混匀，避光孵育20 min，用流式细胞仪检测酵母细胞凋亡率、胞内ROS水平和线粒体膜电位。其中，每个样品由3个平行样品混合，检测不少于50000个细胞。


      1.6统计分析


      采用SPSS 18.0对所得结果进行差异显著性分析，野生酵母中处理组与对照组间的差异
显著性用"*";表示（*p
      2 结 果


      2.1 SOD1、SOD2基因缺失对抑制酵母细胞生长的影响


      从图1A中可以看出，野生株酵母在胁迫下，生长受到抑制；随着浓度的升高，培养液OD600逐渐降低，当浓度为2 mmol/L时，酵母细胞几乎完全停止生长，抑制率高达92.86%。在1 mmol/L和1.5 mmol/L处理组中，培养24 h后，?sod1相对生长率显著低于野生酵母，而?sod2相对生长率与野生酵母无显著差异（图1B）。结果说明，可抑制酵母细胞生长，SOD1基因在细胞生长过程中起重要作用。


   



      图1 对酵母细胞生长的影响下载原图


      Fig. 1 Effect of NaAsO2 on yeast cell growth


      A, WT strain; B, WT and mutant strainsNote: "*"; indicate the significant difference（*p
      2.2 SOD1、SOD2基因缺失对诱导酵母细胞死亡的影响


      由图2可知，野生酵母细胞经胁迫后，细胞相对存活率随砷浓度的升高而逐渐降低。在1~2 mmol/L处理组中，细胞相对存活率显著低于对照组。1 mmol/L和1.5 mmol/L处理组中，?sod1相对存活率显著低于野生酵母，分别为野生株的21.52%和2.09%；?sod2与野
生酵母间无显著差异。根据细胞相对生长率和存活率结果，我们在后续实验中选取1 mmol/L作为处理浓度。


   


      图2 对酵母细胞存活率的影响下载原图


      Fig. 2 Effect of NaAsO2 on the clonogenic survival rate in yeast cells


      Note: "*"; indicate the significant difference（*p
      2.3 SOD1、SOD2基因缺失对诱导酵母细胞凋亡的影响



      为了进一步验证SOD1和SOD2基因在胁迫过程的作用，我们选取采用Annexin V/PI双染法研究了酿酒酵母SOD1、SOD2基因缺失对诱导酵母细胞凋亡的影响。从图3中可以看出，在对照组中，野生株与突变株间早期凋亡率无显著差异；经1 mmol/L胁迫24 h后，所有菌株细胞凋亡率显著高于对照组，而突变株Δsod1和Δsod2细胞早期凋亡率分别为野生株的1.82倍和1.28倍，均显著高于野生株细胞。结果说明，可诱导酵母细胞发生凋亡，而SOD1和SOD2基因在诱导的细胞凋亡中起重要作用。


   


      图3 对酵母细胞凋亡的影响下载原图



      Fig. 3 Effect of NaAsO2 on cell apoptosis in yeast cells measured by flow cytometry assay


      A, Cell apoptosis was measured by Annexin and PI double-staining; B, According to figure ANote: "*"; indicate the significant difference（*p
      2.4 SOD1、SOD2基因缺失对引起酵母细胞ROS水平和线粒体膜电位变化的影响


      用1 mmol/L胁迫酵母细胞24 h后，采用DCFH-DA和Rh123特异性荧光探针检测胞内ROS水平和线粒体膜电位（图4）。经荧光显微镜观察发现，细胞荧光强度均明显高于对照组。胞内ROS水平检测结果显示，在处理组中，所测菌株胞内ROS水平均显著高于对照组，突变株Δsod1胞内ROS水平为野生株的2.98倍，两者间具有显著差异。线粒体
膜电位检测结果显示，酵母细胞经胁迫后，所测菌株中线粒体膜电位均显著下降，其中突变株Δsod1显著低于野生株；ROS水平和线粒体膜电位在Δsod2突变株与野生株间均无显著差异。结果说明，可诱导酵母胞内ROS产生，引起线粒体膜电位下降，而SOD1基因可有效降低引起的胞内ROS水平，并在维持细胞线粒体膜电位中起重要作用。


   


      图4 对酵母细胞内ROS水平和线粒体膜电位的影响下载原图


      Fig. 4 NaAsO2 induces production of intracellular ROS and disruption of mitochondrial membrane potential (?ψ) in yeast cells.



      A, intracellular ROS levels; B, Mitochondrial membrane potentialA, 胞内ROS水平； B, 线粒体膜电位


      3 讨 论


      砷是广泛分布于自然界中的一种有毒元素，对植物、动物和微生物等多种细胞均有一定的毒害作用。已有研究证明，砷化物可抑制小鼠空肠组织的抗氧化物酶活性活性，引起小鼠空肠氧化损伤和组织结构改变；引起植物保卫细胞死亡，并伴随着胞内ROS水平的升高，说明氧化应激机制是砷毒性机制之一。


      ROS是一类机体在有氧代谢过程中产生的活性含氧化合物，在生物正常代谢过程中起重要作用。当机体受到外界刺激时，可引起细胞内抗氧化物酶活性增强，以清除体内由于外界胁迫产生的过量的ROS，从而维持胞内的氧化还原平衡；当胞内ROS产生过多而来不及清除时，机体则会发生氧化应激反应，胞内ROS水平升高。胞内较高浓度的ROS可导致DNA、蛋白质和脂类等生物大分子功能的破坏，或通过攻击蛋白质，使细胞内线粒体膜结构受损，使线粒体膜电位改变，最终引起细胞凋亡或死亡。本实验中，可抑制酵母细胞生长，细胞死亡率和凋亡率升高，同时伴随着胞内ROS水平的升高和线粒体膜电位的下降。在相同浓度砷处理组中，?sod1突变株细胞存活率和线粒体膜电位均显著低于野生株，胞内ROS水平和细胞凋亡率均显著高于野生株；?sod2突变株凋亡率显著高于野生株，而其他检测指标与野生株间均无显著差异。结果说明，可诱导酵母细胞发生依赖于线粒体途径的细胞凋亡，且诱导的酵母细胞死亡与胞内ROS水平相关。


      超氧化物歧化酶是体内关键的抗氧化物酶，在酵母细胞中，编码铜锌超氧化物歧化酶的SOD1基因和锰超氧化物歧化酶的SOD2基因均可特异性清除胞内超氧阴离子，从而降低胞
内ROS水平，以避免ROS对机体的损伤作用。张小华等研究发现，超氧化物歧化酶基因与高温、乙醇和高渗透压等多种胁迫耐受性均密切相关。本研究中，我们以?sod1和?sod2突变株，以及野生株BY4741为材料，研究对酵母细胞的毒性作用。结果显示，酵母细胞经高浓度胁迫24 h后，本研究所用菌株细凋亡率均显著升高；在相同浓度砷处理组中，?sod1和?sod2细胞凋亡率显著高于野生株，说明超氧化物歧化酶基因在胁迫诱导的酵母细胞凋亡中起重要作用。


      综上所述，可诱导酵母细胞内ROS水平升高，线粒体膜电位下降，细胞发生凋亡；SOD1和SOD2敲除后，细胞凋亡率显著升高。结果说明，诱导胞内ROS水平升高是酵母细胞死亡的一个诱因，超氧化物歧化酶基因与诱导的酵母细胞凋亡密切相关。


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