! Lake '(.(湖泊科学)，2020, 32( 2)： 440-449
DOI 10. 18307/2020.0213
reactive oxygen species (ros)© 2020 by Journal of Lake Sciences
草源型可溶性有机物降解过程中活性氧物种产生过程"
刘 新1，吴定桂1,2，江和龙2，宋 娜沖
(1：南京林业大学生物与环境学院#江苏省环境工程重点实验室#南京210037$
(2：中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室，南京210008$
摘要：活性氧物种！ ROS )参与天然水体系统中的光化学反应、氧化还原反应#是影响水体中有机污染物的迁移、转化、 环境归宿及生态效应的重要因素.然而目前对草源型可溶性有机物(DOM )分解过程中ROS 的产生过程并不清楚.本文 通过室内模拟实验#首先构建了室内测定3种ROS ( 3CDOM ! %1O 2、- OH )的方法，进而分析草源植物——苔草(Cars tristachya)残体浸出液中DOM 光降解过程中ROS 的产生过程.结果表明:ROS 累积含量的产生随着DOM 的降解逐渐升 高，在3种自由基含量中# 3CDOM !的产生含量最多# • OH 产生含量低于另外2种ROS 两个数量级.CDOM 含量与 3CDOM ! %1O 2、• OH 浓度呈现正相关关
系，尤其与3CDOM !和】O 2浓度的显著性水平最高# • OH 次之.ROS 浓度与水质 指标呈现出不同的线性相关关系#与硝态氮浓度呈负相关关系#而与亚硝态氮浓度呈现正相关关系#并且亚硝态氮对 ROS 浓度影响效果极显著.同时类蛋白荧光峰值强度的衰减与ROS 累积含量呈现极显著负相关关系#说明在DOM 的光 降解过程中蛋白质小分子的降解是产生ROS 很重要的一个部分.综上#通过对草源型DOM 光降解过程中ROS 产生过程 的研究，增加了对湖泊生态系统中水生植物产生ROS 的过程、迁移、转化、归宿及其作用机制的认识.
关键词：可溶性有机物)活性氧物种；植物残体)光降解)湖泊水体
The productio n process of reactive oxyge n radicals in the degradatio n process of grass - source dissolved organic matt e r *
* 2019-05-06 收稿;2019-09-19 收修改稿.
国家自然科学基金项目(51879256, 5187091383)和江苏省高校优势学科建设工程资助项目(PAPD )联合资助.* * 通信作者；E-mait nsong@niglas.ac .
LIU Xin 1, WU Dinggui 1'2 # JIANG Helong 2 & SONG Na 2**
(1: Nanjing Forestry University # College of Biology and the Environment # Key Laboratory of E
nvironmental Engineering of
Jiangsu Province # Nanjing 210037 # P.R. China )
(2： Staty Key Laborrtoy of Lake Science and Environment # Nanjing Instituty of Geography and Limnology # Chinese Accdemy
of Sciences # Nanjing 210008 # P.R. China )
Abstract : Reactive oxyyen species ( ROS) participate in photochemical reactions and redox reactions in natural water systems , and are importani factoa affecting the migration # transformation # environmental destination and ecological effects of organic poOutanU in watas. However, ROS production process in the deeradation oO grass-source solubEe organic mattes (DOM) is not clear at preseni. In ihis papee , an indooe simulation expeemeni was conducted io establish a method for the determination oO the cumulative values oO three ROS (3 CDOM * , 1O 2 and • OH) in the laboratoiy , and then the production process of ROS in tUc DOM photodeeradation process in the residual leaching solution ot Carex tristach-ya was analyzed. Results showed that the cumulative content ot ROS ic% creased with the dearadation of DOM. Among the three free radical contents , 3 CDOM * has the highest production content , an
d •OH producCon content was two ordere of magnitude lowee than the othee teo ROS. CDOM content was sicnificantly positively coe related with the cumulative concentration of 3 CDOM * , 1O 2 and • OH , especially with the highest sicnificance level of 3 CDOM * and 1O 2 , followed by • OH , consistent wit the ROS production mechanism of CDOM. The accumulation value of ROS concentras eon has a diierent linear cooelation with the watee quality index , which is neaatively cooelated with nitrate nitegen , but positively cooelated with nitite nitrooen(NO^-N) , and the eSfects of NO[-N on ROS concenyatWn are extremely sivnaicant. Meanwhile, the
刘新等：草源型可溶性有机物降解过程中活性氧物种产生过程441
attenuation of the peak fluorescence intensity of protein-like proteins is negatively correlated with the cumulative content of ROS, indicating that the degradation of small protein molecules is an important part of the ROS production in the process of DOM photodegradation.In conclusion#the research on ROS production process in the photodeeradation process of grass-source DOM has increased the understanding of ROS production process,migration#transformation#home and mechanism of aquatic plants in the lake ecosystem.
Keywords:Dissolved organic matteo；reaccve oxyyen species；plant residue；photodeeradation；lake waters
活性氧物种！reactive oxyyen species,ROS）是一类直接或间接的由分子氧转化而来、具有未配对电子的物质，其化学反应活性比分子氧更为活泼，具有强氧化性、能进行链式反应、不稳定、寿命极短以及顺磁性等特点+1卩ROS主要包括超氧阴离子自由基（O；-）、过氧化氢分子！H2O2）、轻基自由基（-OH）、单线态氧（$O2）%可溶性有机质（DOM）三线激发态（'DOM!）等+2-].ROS在天然水体中无处不在，并且在水体的光化学、氧化还原反应中发挥着重要作用：（1）影响有机物，包括有机污染物及难降解有机质在水环境中的降解及转化，如药物⑸、有机磷阻燃剂⑹、多环芳桂⑷、腐殖质⑺等；（2）与水体中微量元素如铁、P、铜和•等反应，进而影响微量元素的化学行为和生物可利用性[#呵；（3）改变水体微生物的落结构和功能〔⑴.过量的ROS可破坏重要生物大分子，对水生生物造成毒害或致死+12-3L ROS在水生生态系统的生物地球化学等领域中，扮演着重要的角，并且成为近年来的研究热点.
天然水体中ROS的来源主要为水体中DOM的光化学反应”⑸，尤其是其中的有可溶性有机物（CDOM）组分.CDOM是一类含有苯环、5基和Q基等发团的复杂混合有机物，能够吸收特定波长的太阳光.在水生生态系统中，藻型湖区、草型湖区存在环境具有显著性差异〔⑹，维持稳定生态系统状态的机理也完全不同，水体中DOM的来源及组分特征也存在较大差异，其中草型水生植物衰亡期植物残体
的腐烂分解是湖泊水体中DOM的重要来源，然而目前关于草源型DOM释放ROS的过程并不清楚口.
实际上，对于湖泊系统尤其是浅水湖泊来说，由于其具有更高的透光性，更强的水土界面物质交换，从而更易受外界环境影响期.因此，随着全球气候变暖，湖泊富营养化，沼泽化过程使得河床被抬高，以及水生植被生态修复技术的推广运用，刺激了浅水湖泊中水生植物的过量生长问.一方面水生植物在去除污染物、净化水质、改善水体治理以及恢复水体生态功能等方面发挥重要作用，其产生的ROS在去除污染物如有机污染物、重金属等方面同时发挥作用削；另一方面，过量水生植物存在下，产生的大量ROS有可能对生态系统造成危害.开展草型湖区水生植物产生ROS过程及机理的研究，既有利于了解水生植物产生ROS的环境行为，也有利于提高水生植物对水体污染物净化能力的认识.
本研究通过室内模拟实验，首先参考并选择了3种ROS（3CDOM!、$O2、-OH）的测定方法，接着选取了
—苔草！tristachya），获得典型草源型DOM提取液，分析了其DOM降鄱阳湖具有代表性的草原植物—
解过程中ROS的产生过程及机理.该研究对认识湖泊生态系统中DOM产生ROS的过程、迁移、转化、归宿及其作用机制具有重要的意义，在湖泊环境治理方面有重要的应用价值，同时为水生植物的生态修复功能提供重要的理论支持，以期对湿地生态系统修复提供一定的科学依据.
6材料与方法
1.1样品采集与处理
植物样品苔草（Ca,&tita（y）采自于鄱阳湖南矶湿地国家级自然保护区（图1），装入聚乙烯密封袋，带回实验室，先用自来水冲洗附着泥土，再用去离子水冲洗3遍后，用吸湿纸去除表面水分.将植株茎和叶剪约为5mm长度，混匀后放入RS中于60g烘干至恒重.称取20r烘干样品，置于5L广口烧杯中，添加4 L蒸”水，避光、室温放置2天，获得DOM浸岀液+2$].
DOM浸岀液用0.45/m玻璃纤维滤膜过滤，再用0.22/m滤膜过滤微生物后，分别取400mL浸岀液加入到500mL广口石英瓶中，并加入捕获剂，每组做3个重复.放置在温度为25g的光照培养箱下，光源为紫外灯！UVA-340,40W,LH仪器有限公司，北京，中国），并且避免其它光源干扰.对照组用锡箔纸做避光处理•无DOM的对照组为纯水中添加实验初始浓度捕获剂.在实验一周内，每天按时采集DOM降解液.水样在2d内完成理化、光学指标的测定.
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J. Lake ScC (湖泊科学),2020,32(2)
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115。50' 116。15' 116。40'图1鄱阳湖采样点位
F iv .1 The sampling site in Lake Poyanr 1.2检测及计算方法121 ROS 测定方法 本实验中测定3种ROS ：
3CDOM ! ,O 和• OH ，分别用2,4,6-三甲基苯酚！TMP ）、
咲喃甲醇（FFA ）和苯酚进行捕获+22-23]，捕获剂同时添加,
初始浓度分别为l 、l 、2mmol/L ，其中• OH 检测产物为苯
酚.测定在高效液相谱仪（Agilent 1200 series ）上进行,
紫外检测器进行检测，所有样品用甲醇和磷酸盐缓冲液
（pH 2.8）洗脱，洗脱液为60 ：40（甲醇：磷酸盐缓冲液）混 合物，流速为12 mL/min ,TMP 保留时间11 min , FFA { 留时间32 min , • OH 检测产物苯酚保留时间42 min ，检 测波长为220 nm.测定TMP 、FFA 、苯酚的标准曲线，以及 DOM 降解过程中3CDOM ! JO ?和• OH 的浓度.1.2.2紫外光谱测定 CDOM 吸收光谱采用SHIMADZU UV-2550紫外可见分光光度计进行全波段扫描，扫描波 长范围为200〜800 nm ，比皿为1 cm 的石英槽，以Mili- Q 水作空白，按公式（3）〜!4）进行计算+24]:a r （ %） = 2.303XOD （入）/-
（3）a （入）=a f （入）-a'（ 700） • %/700 （4）
式中,a '（入）和a （入）分别为未经散射校正和经过散射校
正过后波长％处的吸收系数,m T ; i 为比皿光程,m ； OD
（入）为样品在波长％处的吸光度值.本文采用波长280 nm 的CDOM 吸收系数来表征
CDOM 浓度+ 25]. CDOM 的光谱特征是由DOM 的组分和
浓度共同决定的，通过如下公式+26]将CDOM 吸收系数标准化，可表征单位DOC 浓度的CDOM 对光的吸收能力:
a !（入）5a （入）/[ DOC ] （5）
式中,a !（入）为波长％处的CDOM 比吸收系数,L （ mr-m ）.
吸收光谱斜率S 值的确定:CDOM 吸收光谱从紫外到可见波长随波长的增加大致呈现指数衰减规律, 公式为+27]:
a （入）5 a （ %0） exp [ S （入。-％）] （6）
本文采用光谱斜率比值（SQ 表征CDOM 分子量的变化，其计算方法为+ 28]:
S R =S (275-295) L (350-400)(7)
1.2.3水样的基础理化性质分析水样中F 态氮、亚硝态氮、硝态氮、总氮（TN ）、可溶性无机磷（DIP ）及可溶性有机磷（DOP ）.采用过硫酸盐氧化法测定全氮；磷钮蓝比法测定无机磷和有机磷；过硫酸钾法测定总磷 （TP ）、采用纳氏比法测定F 态氮（NH ；-N ）；硝态氮（NO -N ）和亚硝态氮（NO --N ）浓度采用全自动智能化 学分析仪（Smttchem 200, AMS-Westcc ，意大利）进行测定.可溶性有机碳（DOC ）浓度利用连续流动分析仪（Future , Allitce ，法国）测定，用邻苯二甲酸氢钾标准储备液稀释梯度作为标准曲线对照.
1.2.4三维荧光光谱测定 水样稀释10倍后采用三维荧光分光光度计（Hitachi F-4500）测定水样的三维荧 光光谱（EEMs ）.激发波长（Ex ）和发射波长！ Em ）的扫描区间分别为200〜450和250〜600 nm ，
步长分别为5 和1 nm ，扫描速率为2400 n^min ，带宽裂缝均为5 nm ，光电倍增管电压为800 V.扫描光谱进行仪器自动校 正，以Milli-N 水作为空白.
12统计分析
采用MATLAB 进行数据拟合.采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析,8〉0.05表示未达到显著检验水 平;0.01<8<0.05为显著水平,8<0.01为极显著水平.采用Origin 8.5软件绘图
.
刘 新等：草源型可溶性有机物降解过程中活性氧物种产生过程4437结果与讨论
2.1 ROS 测定方法的构建
由于自由基具有半衰期极短、浓度低等特点，故准确检测自由基的种类及含量是有关ROS 研究的前提. 目前用于检测自由基的方法有：电子自旋共振（ESR ）技术、化学发光法、高效液相谱法、分光光度法、电化 学法等+ 29%°].其中，高效液相谱法是自由基的间接测量方法，具有可持续测定、快速、高效等优点.已有研 究报道化学发光探针——MCLA 可用于O 2 -的检测，检测限低至1.41 pmol/s [31'32]. TMP 、FFA 和苯可以分别 做捕获剂进而用高效液相谱法测定水体中3CDOM * %1O 2和-OH 浓度〔33〕.对于TMP 、FFA 和苯酚的紫外检 测波长分别为220、230和210 nm #洗脱液的比例也不相同，
并且以往的研究都是采用单独添加一种捕获剂 的办法对一种ROS 测定，需要耗费大量的时间和样品量.本研究结合已有的方法，将3种捕获剂同时添加， 在紫外检测波长220 nm 、洗脱液为60：40（甲醇：磷酸盐缓冲液）条件下对于提取的样品一次进样#分别在3 个对应的保留时间岀峰，测定实验中ROS 的产生及变化，目前已成功测定水体中3CDOM * %1O 2和-OH 浓度 （表1） #大大缩短了实验时间.
表1 3CDOM * %1O 2和-OH 标准曲线及其检测范围
Tab. 1 Standard curves of 3 CDOM * # 102 and • OH and theis detection ranges
3cdom *102-OH
标准曲线
（U 二浓度,\二峰面积） 检测范围1-X/1986(1 = 0.9998)0.01 ~ 1 mmol/L 1-X/2208(1 = 0.9988) 0401 ~1 mmoaLL U=X/14056(1 = 0.9991)
0.005 ~0.05 mmoaLL
2.2草源型DOM 降解过程中DOC 变化情况
DOM 光化学降解有两个途径，一是直接光降解，即溶
解性有机质直接吸收光的能量发生的降解变化#另一个是
间接光解，通过光照过程中生成的ROS 的氧化作用；水中
存在的中间介质吸收光子经过电子转移过程将能量传递给
有机质，激发态的有机质进一步反应生成ROS [34]，在光降解
DOM 产生ROS 的过程中,DOC 是一项直接反映DOM 降解
情况的指标.如图2所示,DOC 浓度从初始的1906.8 mg/L
降为实验结束后的275.4 mg/L ，紫外条件下草源型DOM 浸
出液光降解效果显著.在降解中后期（2~8 d ） ,DOC 浓度在 持续下降，在2~4d 期间降幅较大，之后平稳下降.另外本
实验设置了无光无微生物的对照组，实验结果显示无光无
微生物处理下对DOC 的降解没有影响.另外在无DOM 的 对照组中,DOC 浓度变化同样很低，推测主要由于3种捕获 剂一一TMP 、FFA 和苯在短时间内光降解反应速率很低的
原因+ 3曲.
时间/d
图2草源型DOM 及对照组 降解过程中DOC 浓度Fiv.2 Changes of DOC concentration
during dearadation of grass-source
DOM and control group 22草源型DOM 降解过程中ROS 变化
在DOM 降解过程中，从ROS 产生来看3种自由基浓度均随着降解时间的延长而都有明显的增加（图3），其中• OH 累积浓度在第7天和第8天有一定程度的下降.实验结束时,3CDOM *累积浓度与“2相近，分 别为0.87和0.99 mmol/L ，而最少累积浓度的ROS 为• OH ，为0.026 mmol/L.本实验证实了草源型DOM 能 够在光分解过程中产生大量ROS ，并且ROS 随时间增加而逐渐上升.并且这种关系与捕获剂的选择性加入 密不可分，捕获剂持续捕获DOM 降解过程产生的ROS ，在随着时间的推移而逐渐累积的过程中，既保证了 ROS 不会长时间处于游离状态，也阻止了 ROS 参与其它化学反应，使得ROS 能够稳定累积
.
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O.
O.
O.6
a
/d
间 时图3 DOM 降解过程中3CDOM *( A )%102( B )、- OH (C )的浓度变化
Fiv ，3 Changes of 3CDOM * ( A )，102( B ) and • OH ( C ) concentrations during the dearadation of DOM 22草源型DOM 分解过程中ROS 产生机理分析
2.4.1 CDOM 对ROS 产生的影响 由图4A 可知，捕获剂对光谱吸收系数影响较小.在此基础上分析CDOM 的光谱吸收系数.CDOM 光谱吸收系数总体上呈现指数形式单调衰减，200〜250 nm 处紫外波段吸收系数最 大，350 nm 以后的波段吸收曲线较为平滑(图4B )，这与国内外学者公认的CDOM 光吸收特征相符合，因此 CDOM 在光降解过程中吸收度的减小具有不均衡性，对光的吸收也具有选择性，吸收损失都主要发生在320 nm 以下的紫外区，其中UVB (275-320 nm )波段无论对陆源DOM ，还是对生物自生源的DOM ，都是最有效 的辐照光谱区+21L 在275 nm 附近存在一显著的肩，该肩值与Warnock 等⑶〕的报道结果一致，并且肩峰随着 DOM 光解时间的增加而增强，从实验初期无肩峰到后期肩峰突岀十分明显.然而，随着DOM 降解时间的增 加，CDOM 相对浓度在第2天略微下降后开始上升，在第8天达到最大值.另外，图4C 给岀了光谱斜率比值 'r ，'r 表征CDOM 的平均相对分子量，根据'
r 与相对分子量呈反比的关系可以看到随着DOM 光解时间的增 加，CDOM 分子量逐渐降低，说明大分子逐渐被光降解为小分子.
50
4030QOUBqJosqv -----Day 1-----Day 2——Day 3—Day 4— Day 5-----Day 6——Day 7—
—Day 8——无DOM 对照组波^nni 400O
8
6 4 2
(?•$©$«((日・a E )n )、(o &*«4 3 2 1 0500 200 250 300 350 400波45005O 24间 时37
6图4 DOM 和捕获剂的的紫外可见吸收光谱! A )和CDOM 比吸收系数随波长的变化！ B )及 CDOM 相对浓度和光谱斜率比值S r ( C )Fiv.4 Ue-vis spectra of DOM samples and probes ( A) and CDOM absorption coefficient with dtferent wavelengths ( B) and relative concentrations of CDOM and spectral slope ratio S r ( C)进一步分析表明，随着DOC 浓度的降低,CDOM 组分中容易光降解部分先得到快速降解,$*(280)先有 微弱降低(图4B )，后剩余难光降解部分，光解速度较慢，但由于DOC 在持续降低，标准化后的CDOM 吸收 系数！$(280)/[DOC ])在第2〜8天能够呈现明显上升趋势，整体与ROS 累计含量呈现正相关关系(表2) # 尤其与3CDOM * JO?浓度显著性水平较好(8=0.031、0.035)，相关系数分别为0.753、0.742.虽然CDOM 与 -0H 呈现正相关关系，但显著性水平一般(8=0.231).结果证明ROS 的产生与D0M 中的光敏感物质—— CDOM 密切相关,CDOM 中含有大量的发基团，是重要的天然光敏剂，在紫外辐射或太阳光照射下吸收光 子能量，引发一系列反应.单线态(state DOM singlet,1 DOM)分子吸收光能先转化为激发单线态(excited state DOM singlet ，1 DOM * )，进而转化为激发三线态(excited state DOM triplets ，3 DOM * )(公式！ 8))，进一步与溶 解氧分子等发生一系列反应(公式(9) ~(⑵)，产生3CDOM * JO?、- 0H 等活性中间体[36].
CDOM + h v &1 CDOM & 3CDOM * (8
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