生态毒理学报
Asian Journal of Ecotoxicology
第18卷第2期2023年4月
V ol.18,No.2Apr.2023
㊀㊀基金项目：国家自然科学基金面上项目(52170185,52070111)；国家自然科学基金重点项目(51938001)；中国博士后科学基金面上项目
(2022M721815)；清华大学 水木学者 计划
㊀㊀第一作者：苏志国(1994 )，男，博士，研究方向为环境微生物学,E -mail:******************㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:*************
DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20221227001
苏志国，陈伟东，郑宇涵，等.基于宏基因组学解析不同污水处理系统的耐药基因组分布特征和传播机制[J].生态毒理学报,2023,18(2):1-13Su Z G,Chen W D,Zheng Y H,et al.Distribution characteristics and transmission mechanism of antibiotic resistome in different wastewater treatment systems based on metagenomic analysis [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(2):1-13(in Chinese)
基于宏基因组学解析不同污水处理系统的耐药基因组分布特征和传播机制
苏志国1,2，陈伟东2，郑宇涵2，危婕2，李菲菲1，陈嘉瑜3，陈吕军1,4，温东辉2,*
1.清华大学环境学院，北京100084
2.北京大学环境科学与工程学院，北京100871
3.上海师范大学环境与地理科学学院，上海200234
4.浙江清华长三角研究院生态环境研究所，浙江省水质科学与技术重点实验室，嘉兴314050收稿日期:2022-12-27㊀㊀录用日期:2023-02-09
摘要：污水处理厂是向水环境中传播抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的热点㊂与城镇污水相比，工业园区废水成分复杂㊁污染物浓度高，更有利于ARGs 的增殖和扩散㊂为探究不同类型废水环境的ARGs 组成特征和潜在的传播风险，采用宏基因组学技术分别对城镇生活污水处理系统(W1-SD)㊁工业园区废水处理系统(W1-SI)和2个城镇综合污水处理系统(W2-LH1和W2-LH2)进行取样调查㊂结果显示，多重耐药类㊁磺胺类㊁氨基糖苷类和杆菌肽类抗性基因是废水环境中的主要耐药类型,Ⅰ型整合子㊁转座酶基因等可移动遗传元件(MGEs)对sul1㊁aadA 和ereA 等基因亚型的增殖扩散发挥了关键作用，通过序列分型发现质粒型ARGs 的相对丰度更高，尤其是在进水样品中，氨基糖苷类和磺胺类等抗性基因是主要的质粒型ARGs ；污水处理过程削减了ARGs 多样性，且经过二次沉淀工艺,ARGs 丰度均
明显降低，但在W1-SI 和W2-LH2中，后续的深度处理工艺又使ARGs 丰度升高；与城镇污水处理系统相比,W1-SI 的ARGs 组成更为稳定，最终排水中富集了较高丰度的质粒型ARGs ，同时识别到了高频率的潜在水平基因转移事件和2条携带多种抗性基因的重叠序列(contigs)，表明工业园区废水排放具有更高的ARGs 传播风险㊂本研究丰富了不同类型废水环境耐药基因组的已有认知，为有效管控废水排放特别是工业园区废水排放的健康风险提供了科学依据㊂
关键词：抗生素抗性基因(ARGs)；污水处理厂；工业废水；宏基因组；传播机制文章编号:1673-5897(2023)2-001-13㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:A
Distribution Characteristics and Transmission Mechanism of Antibiotic Resistome in Different Wastewater Treatment Systems Based on Met-agenomic Analysis
Su Zhiguo 1,2,Chen Weidong 2,Zheng Yuhan 2,Wei Jie 2,Li Feifei 1,Chen Jiayu 3,Chen Lyujun 1,4,Wen Donghui 2,*
1.School of Environment,Tsinghua University,Beijng 100084,China
2.College of Environmental Sciences and Engineering,Peking University,Beijing 100871,China
3.School of Environmental and Geographical Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,
China
2㊀生态毒理学报第18卷
4.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Water Science and Technology,Department of Environment in Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University,Jiaxing314050,China
Received27December2022㊀㊀accepted9February2023
Abstract:Wastewater treatment plants(WWTPs)are hotspots for the spread of antibiotic resistance genes(ARGs) into the aquatic environment.Compared with domestic wastewater,wastewater from industrial parks has complex composition and high pollutant concentration,which may be more conducive to the proliferation and diffusion of ARGs.In order to explore the composition characteristics of ARGs in different types of WWTPs and their potential transmission risks,metagenomics was used to investigate the antibiotic resistome in a domestic WWTP(W1-SD), an industrial WWTP(W1-SI),and two integrated WWTPs(W2-LH1and W2-LH2).The results showed that multi-drug,sulfonamide,aminoglycoside and bacitracin resistance genes were the main ARG types in the WWTPs.Mo-bile genetic elements(MGEs)such as typeⅠintegron and transposase genes played key roles in the proliferation and diffusion of ARG subtypes such as sul1,aadA,and ereA.Sequence typing s
howed that the relative abundance of plasmid-borne ARGs was higher than other types of sequences,especially in the influent samples,and amin-oglycosides and sulfonamides resistance genes were the main plasmid-borne ARGs.The diversity of ARGs was re-duced in the wastewater treatment process,and the abundance of ARGs decreased significantly after secondary pre-cipitation.However,in W1-SI and W2-LH2,the abundance of ARGs increased after advanced treatment.Com-pared with the domestic wastewater treatment system,the ARGs composition of W1-SI was more stable.A higher abundance of plasmid-borne ARGs was enriched in the final effluents.Meanwhile,a high frequency of potential horizontal gene transfer events and two contigs carrying multiple resistance genes were identified.The results indi-cated that wastewater discharge from the industrial parks had a higher risk of ARGs transmission than urban area. This study enriches the existing knowledge of antibiotic resistome in different types of WWTPs,and provides a sci-entific basis for the health risk management of wastewater discharge,especially in industrial parks. Keywords:antibiotic resistance genes(ARGs);wastewater treatment plants(WWTPs);industrial wastewater;met-agenomics;transmission mechanism
㊀㊀污水处理厂(wastewater treatment plants,WWTPs)被认为是抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的重要储存库，许多研究对WWTPs样品中的ARGs多样性和丰度进行了调查[1]，然而以
往研究主要关注的是汇集了居民生活㊁医疗卫生㊁畜禽养殖和部分工业生产等各方面污水的城镇污水处理厂；但是汇集各类工业废水的工业园区废水处理系统尚未被深入研究㊂工业园区特别是化学工业园区的废水通常含有大量的异源生物质，如抗生素㊁重金属㊁表面活性剂和消毒剂等，这可能为抗生素耐药性(antimicrobial resistance,AMR)的传播提供了 最佳条件 [2]㊂有研究表明，城市绿地[3]和工业园区土壤[4]中ARGs的发生和分布与工业活动密切相关，一些制药厂废水可能在很大程度上促进了水环境中ARGs的传播扩散[5-7]㊂因此，有必要研究工业园区废水的耐药基因组特征，并评估其对环境AMR发展的相对贡献㊂
质粒㊁转座子和整合子等可移动遗传元件(mo-bile genetic elements,MGEs)是ARGs在WWTPs中广泛分布和传播的重要驱动因素之一[8]㊂以往研究多基于PCR检测和相关性分析来探索ARGs与MGEs的相互关系，但是无法揭示二者在遗传上的直接关联，很难有效识别不同ARGs的水平转移机制㊂近年来，宏基因组学技术快速发展，为全面解析耐药基因组提供了有力支撑，通过将短序列进行组装的方法，可以获得ARGs的遗传位置信息，进而分析ARGs侧翼序列的基因组成，识别其与MGEs的共存模式㊂此外，众多杀菌剂和金属抗性基因(bio-cide and metal resistance genes,BMGs)与ARGs在遗传上存在着频繁的共现关系，反映了废水环境中多种化学污染物对AMR的共选择潜力[9]㊂
本研究基于宏基因组学方法，分析了城镇生活污水处理系统(W1-SD)㊁工业园区废水处理系统(W1-SI)以及2个城镇综合污水处理系统(W2-LH1
第2期
苏志国等：基于宏基因组学解析不同污水处理系统的耐药基因组分布特征和传播机制3
㊀和W2-LH2)中ARGs 的组成特征，识别了不同类别ARGs 的遗传位置(质粒和染体)，探究了MGEs ㊁BMGs 等基因与ARGs 的相互关系，并进一步评估不同类型废水中ARGs 的潜在传播风险㊂1㊀材料与方法(Materials and methods )1.1㊀污水处理系统与采样点设计
本研究选择浙江省2个典型的WWTPs(W1和
W2)作为研究对象㊂W1位于杭州湾南岸，接纳和处理来自某城区㊁乡镇的生活污水，以及某精细化工园区的工业废水㊂该污水厂的总处理规模为22.5万m 3
㊃d -1
，由2条规模为11.25万m 3
㊃d -1
的污水处理
系统构成，分别处理城镇生活污水(W1-SD)和化工园区废水(W1-SI)㊂W1-SD 采用以厌氧-缺氧-好氧单元(anaerobic -anoxic -oxic tank,A 2
O)为核心的工艺路线,W1-SI 在A 2
O 工艺基础上增加芬顿(Fenton)和活性焦吸附工艺进行深度处理(图1)㊂化工园区内所有工业企业排放的废水均经由管网汇入W1-SI ，其中染料㊁医药和农药等化工企业的废水占比最大，这些废水具有成分复杂㊁有毒有害污染物浓度高㊁可生化性差等特点，处理难度大㊂目前生活出水
执行GB 18918一级A 标准，工业出水执行GB 8978一级标准，其中化学需氧量(COD)排放标准为ɤ80mg ㊃L -1㊂
W2位于杭州湾北岸，接纳和处理来自某城市
的城镇综合污水，生活污水和工业废水的比例大致相等，其中工业废水包括了石油化工㊁纺织印染和机械加工等废水类型㊂该污水厂的总处理规模为60万m 3㊃d -1，包括一期(W2-LH1)和二期(W2-LH2)工程，处理规模均为30万m 3㊃d -1㊂W2-LH1在生化处理阶段分为2条线(各处理15万m 3㊃d -1)，其中一条线增加膜生物反应器(membrane bio -reactor,MBR)工艺，后续又合并进行高效沉砂㊁消毒氧化等深度处理;W2-LH2采用A 2O 加深度处理的三级处理工艺㊂目前两期工程的出水水质均执行GB 18918一级A 标准㊂
如图1所示，本研究在4个独立运行的污水处理系统(W1-SD,W1-SI,W2-LH1,W2-LH2)采集进水(influent,INF)㊁二次沉淀池出水(secondary clarifi -er,SC)和最终出水(effluent,EFF),W1-SD 的二次沉淀池出水即为最终出水㊂以上污水处理系统均通过排海泵房将最终出水排入杭州湾
㊂
图1㊀各个污水处理系统工艺流程与采样点
Fig.1㊀Treatment process flow and sampling sites of each wastewater treatment system
4㊀生态毒理学报第18卷
1.2㊀样品采集㊁预处理与水质测定
污水处理系统的采样工作于2020年10月进
行，工艺均在设计负荷下正常运行，并且无暴雨等突发事件㊂使用有机玻璃采水器采集不同污水处理系统进水(500mLˑ3)㊁二次沉淀池出水(1000mLˑ3)和最终出水样品(1500mLˑ3)，保存于无菌聚乙烯瓶中，在0~4ħ条件下运回实验室，并在24h之内采用0.22μm混合纤维素酯滤膜(Millipore，德国)过滤截留水样中的细菌细胞，每张滤膜分别过滤适当体积的INF(50~100mL)㊁SC(200~600mL)和EFF (400~1000mL)样品，每个样点获得3~4张滤膜后存放到-20ħ冰箱直至处理㊂同时，根据‘水和废水监测分析方法(第四版)“测定污水的基本水质指
标，包括pH㊁氨氮(NH
3-N)㊁总氮(TN)㊁总磷(TP)和COD㊂
1.3㊀DNA提取与宏基因组测序
将0.22μm滤膜剪碎为2~3mm尺寸的方块，转移到DNA提取试剂盒的DNA提取管中㊂之后，采用PowerSoil DNA Isolation Kit(Mo Bio，美国)试剂盒进行DNA提取，具体操作参见试剂盒的操作说明书㊂提取完成后，采用1%琼脂糖凝胶电泳对DNA的片段长度进行检测㊂电泳条件为：电压100 ~110V，通电时间为40min，并使用λDNA/HindⅢ(TianGen，北京)作Marker㊂使用Nanodrop2000型微量分光光度计(Thermo Fisher，美国)对DNA浓度和纯度进行检测，保证OD260/280在1.8~2.0之间㊂提取纯化后的DNA保存在-20ħ冰箱中，待后续实验㊂
检测合格的DNA样品加入fragmentation buff-er，采用超声波细胞破碎仪进行随机打断，将打断后得到的短片段DNA用于文库构建，建好的文库需进行文库质检，对于质检合格的文库将采用Illumina HiSeq2500高通量测序平台进行PE150测序，测序得到的原始图像数据文件，经碱基识别(base calling)分析转化为原始测序序列(raw reads)，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息㊂基因测序工作委托广东美格基因科技有限公司进行㊂原始序列上传至NCBI Sequence Read Archive (SRA)数据库(PRJNA718910)㊂
1.4㊀生物信息学分析
1.4.1㊀序列质控㊁组装和基因预测
本研究共获得186Gb的原始数据，基于北京大学高性能计算平台，使用一系列生物信息学工具实现宏基因组测序数据的分析㊂
(1)序列质控和评估：首先使用FastQC(v0.11.
8)[10]评估原始序列(raw reads)的整体质量，基于KneadData流程(github/biobakery/kneadd-ata)实现序列的质量控制，包括利用软件Trim-momactic(v0.39)[11]去除序列的双端接头序列和低质量序列(参数设置:SLIDINGWINDOW:4:20MINLEN: 50)，通过软件Bowtie2(v2.3.5)[12]去除宿主污染㊂
(2)序列组装和评估：采用软件MEGAHIT (v1.1.3)[13]对每个样本的clean reads进行de novo 拼接(参数设置:k-min27k-max191step20)，获得重叠序列(contigs)，筛选拼接长度在500bp以上的contigs进行后续分析㊂序列组装的效果通过软件QUAST(v5.0.2)[14]来进行评估㊂
(3)基因预测和定量：采用软件Prodigal(v2.6.3)[15]对contigs进行ORFs(open reading frames)预测(参数设置:-p meta)，利用软件CD-HIT(v4.8.1)[16]对获得的ORFs进行聚类(参数设置:-aS0.9-c0.95)，获得非冗余基因集；使用软件Salmon(v0.13.1)[17]计算出每个基因的reads count，并进一步标准化，获得TPM (transcripts per kilobase million)值，用以表征基因在各个样品中的丰度信息㊂
1.4.2㊀基于清洁序列的ARGs注释
使用ARGs-OAP(v2.0)[18]流程获得样品中ARGs 的组成㊂该流程分为2步，第一步是使用UBLAST 工具(v11.0.667)从质控后的宏基因组clean reads中预先筛选ARGs相似序列，第二步是使用BLASTX 工具(v2.2.28+)按照默认的参数设置(e-valueɤ10-7，序列相似度ȡ80%，比对长度ȡ25aa)将上述相似序列与SARG(v2.2)数据库进行比对，并根据SARG的分级结构进行ARGs的注释和分类㊂基于CARD数据库(aster.ca/home)匹配不同ARGs的抗性机制㊂根据下列公式[18]，对宏基因组数据中ARGs的丰度进行标准化，单位为ARGs 拷贝数/细胞数量(copies㊃cell-1)，可在不同样品或不同基因类型之间进行自由比较㊂
ARG丰度=ð
n
i=1
N
i(mapped reads)ˑL reads/L i(reference reads)
细胞数量
细胞数量=
N
16S sequenceˑL reads/L16S sequence
N
16S copy number
式中:N i
(mapped reads)
是宏基因组clean reads中比对到
某条特定ARG参考序列的序列条数;L
reads
是Illu-
第2期苏志国等：基于宏基因组学解析不同污水处理系统的耐药基因组分布特征和传播机制5
㊀
mina高通量测序获得的序列长度(150bp); L
i(reference reads)
是某条特定ARG参考序列的长度;
N
16S sequence
是宏基因组clean reads中被鉴定为16S
rRNA基因的序列条数;L
16S sequence
是所有16S rRNA
基因序列的平均长度(1432bp);N
16S copy number
是微生物细胞中16S rRNA基因序列的平均拷贝数;n是样品中被注释到属于某个ARG类型或亚型的参考序列个数㊂
1.4.3㊀基于contigs的ARGs及其他功能基因注释
利用BLASTP工具(v2.6.0)将非冗余基因集分别与SARG数据库㊁MGE数据库(github/ KatariinaParnanen/MobileGeneticElementDatabase)和BacMet数据库(v2.0,bacmet.biomedicine.gu.se/)进行比对，获得ARGs㊁MGEs和BMGs等基因的组成㊂序列比对参数为e-valueɤ10-5，序列相似度(i-dentity)ȡ80%，序列覆盖度(coverage)ȡ70%㊂1.4.4㊀基于contigs的序列分型
利用软件Plasflow(v1.1)[19]按照默认参数(-c0.7)对contigs(根据软件开发人员的建议，将序列长度<1000bp的contigs排除在外)进行分型，识别出染体序列和质粒序列，并分析2类序列所携带的ARGs组成㊂利用软件WAAFLE(huttenhower. sph.harvard.edu/waafle)筛选不同宏基因组数据集中发生水平基因转移事件的contigs(>500bp)㊂1.5㊀统计分析和绘图
使用非度量多维标度(non-metric multidimen-sional scaling,NMDS)分析探索和可视化不同样本分组之间
ARGs组成的相异程度，输入数据为已经计算好的两两样品间的距离测度矩阵(Bray-Curtis 距离)㊂使用置换多元方差分析(permutational multi-variate analysis of variance,PERMANOV A)确定2个矩阵之间差异的显著性㊂如果计算得到的P值<0.05，则表明2组数据或2个矩阵之间具有显著差异,P值采用BH(Benjamini&Hochberg)方法进行校正㊂使用Origin2018b或R语言包ggplot2㊁pheat-map绘制堆积图㊁柱状图和热图㊂使用R语言包genoPlotR绘制不同基因在contigs上的排列结构图㊂通过R语言包circlize绘制Circos图展示序列类型与ARGs类型的对应关系㊂
2㊀结果与讨论(Results and discussion)
2.1㊀不同类型废水ARGs的结构组成和变化规律
基于ARGs-OAP流程对4个污水处理系统不同废水样品的宏基因组clean reads进行ARGs注释，共识别到477种ARGs亚型，分别编码17种抗性类型和6种抗性机制㊂如图2(a)和图2(c)所示，多重耐药类(multidrug,13.4%~65.6%,6.20ˑ10-2
reactor的特点~8.53ˑ10-1copies㊃cell-1)㊁磺胺类(sulfonamide, 2.5%~24.9%,3.31ˑ10-2~6.04ˑ10-1copies㊃cell-1)㊁氨基糖苷类(aminoglycoside,1.6%~19.9%,1.92ˑ10-2~5.60ˑ10-1copies㊃cell-1)㊁杆菌肽类(bacitracin, 3.1%~19.0%,3.71ˑ10-2~2.47ˑ10-1copies㊃cell-1)㊁大环内酯-林可酰胺-链霉素类(MLS,1.2%~13.1%, 1.54ˑ10-2~3.70ˑ10-1copies㊃cell-1)㊁β-内酰胺类(be-ta-lactam,2.0%~11.6%,1.05ˑ10-2~3.21ˑ10-1cop-ie
s㊃cell-1)和四环素类(tetracycline,1.3%~12.7%, 8.73ˑ10-3~3.57ˑ10-1copies㊃cell-1)抗性基因是样品中主要的ARGs类型，这与其他研究中WWTPs的ARGs筛查结果较为一致[20]㊂同时，如图2(b)所示, 477种ARGs亚型主要通过抗生素外排(efflux, 26.1%~59.0%)㊁抗生素灭活(inactivation,5.0%~ 41.4%)㊁抗生素靶标替代(target replacement,2.6%~ 25.2%)和抗生素靶标改变(target alteration,4.5%~ 20.2%)等机制表达相应的耐药性，特别是绝大部分多重耐药类基因表现为抗生素外排机制，在各样品中均占据主导地位，这表明多药外排系统是环境微生物表达耐药性的重要途经[21]㊂
进一步计算了不同样品中ARGs的丰富度指数和总相对丰度，如图3所示㊂结果表明2个城镇综合污水处理系统的INF样品中ARGs的多样性(W2-LH1:347,W2-LH2:333)和相对丰度(W2-LH1:2.82copies㊃cell-1,W2-LH2:2.14copies㊃cell-1)更高，而工业园区废水处理系统(W1-SI)接收的ARGs多样性(260)和相对丰度(1.24copies㊃cell-1)最低，这可能是因为工业进水中有毒有害的污染物浓度高，对微生物有持续的杀灭作用，导致微生物量和相关基因丰度的下降㊂污水处理过程对ARGs的多样性有一定的削减作用，从4个污水处理系统的INF到EFF,ARGs的丰富度指数均发生降低，但最终排水中依然含有较多种类的ARGs(145~270)㊂对于ARGs的相对丰度来说，经过二次沉淀工艺, SC样品中ARGs的总丰度均有较为明显的下降，表明通过二次沉淀池泥水分离将ARGs转移至污泥相是削减水相ARGs的重要途经[22]；但是经过后续的深度处理，只有W2-LH1的EFF样品中ARGs总丰度持续下降,W1-SI和W2-LH2的EFF均相较于SC

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