基因组学与应用生物学,2020年，第39卷，第12期，第5625-5630页
研宄报告
Research Report
一*株聚憐菌的分罔、鉴定及其除憐特性分析
朱荣贵方春玉周健明红梅陈蒙恩姚霞邹月姜秀娟‘
四川轻化工大学生物工程学院，自贡,643000
*通信作者，******************
摘要为了研究聚磷菌的分离、鉴定以及除磷特性，本研宄通过富集培养、分离培养、MOPS(10>〇培养、异 染颗粒染实验，并对CA SS反应器中的活性污泥进行了聚磷菌的初筛和除磷能力复筛，得到一株除磷能力 较强的菌株P2。结合形态学、生理生化试验和分子生物学鉴定试验对P2进行菌种鉴定以及行相关性能试验 研究。结果表明：分离所得的菌株P2是一株柠檬酸杆菌，其除磷率可达到85%；菌株P2的生长迟缓期为 0〜6h，对数生长期为6〜24 h；菌株P2高效除磷的最适p H值为7，温度30°C，时间12 h，微量元素浓度为 2 mL/L。菌株P2稳定期持续时间长，适应环境能力较强，对于各种环境下废水中磷的去除有较好效果。
关键词聚磷菌，柠檬酸杆菌，除磷特性
Analysis of The Isolation and Identification of a Phosphorus-accumulating Bacterium and Its Characteristic of Phosphorus Removal
Zhu Ronggui Fang Chunyu Zhou Jian Ming Hongmei Chen Mengen Yao Xia Zou Yue Jiang Xiujuan* Biotechnology Engineering Dept, Sichuan University of Science & Engineering, Zigong, 643000
*Correspondingauthor,******************
DOI: 10.13417/j.gab.039.005625
Abstract In order to study the separation,identification and phosphorus removal characteristics of phosphorus-ac­cumulating,a bacterial strain P2 with strong phosphorus removal ability was obtained by accumulation culture, isolating culture,MOPS(lOx)culture,metachromatic granular dyeing experiment,and primary screening of phos­phorus-accumulating and re-screening of phosphorus removal ability from activated sludge in CASS reactor.The bacteria type of P2 was identified and the related properties of P2 were tested by morphology,physiological and biochemistry test and molecular biology identity test.The results showed that the bacterial strain P2 obtained by separation was a Citro
bacter with a phosphorus removal rate of85%. The growth lag phase of bacterial strain P2 was0〜6 h,and the logarithmic growth phase was6〜24 h.The optimum pH value for efficient phosphorus removal of bacterial strain P2 was7,the temperature was30 °C,the time was 12 h,and the concentration of trace elements was2 mL/L.Strain P2 has a long stable period and strong adaptability to the environment.It has a good effect on phosphorus removal from wastewater in various environments.
Keywords Hosphorus-accumulating bacterium,C i t r o b a c t e r sp.,Characteristic of phosphorus removal
磷为水体富营养化的诱发因子的概率高达67%磷量对预防水体富营养化尤为重要。目前，国内外应(Conley et al.，2009; Pan et al.，2009)，严控出水中含用较多的除磷方法有化学、生物和生化除磷法等。生
基金项目：本研究由酿酒及生物技术四川省重点实验室项目(NJ20I4-05)、泸州老窖科研奖学金项目（151jzk06)、四川省教育厅项 目（16ZB0244)、四川轻化工大学校级人才引进项目(2015RC04)和校级大学生创新创业项目(cx2018039)共同资助
引用格式：Zhu R.G.，Fang C.Y.，Zhou J.，Ming H.M.，Chen M.E.，Yao X.，Zou Y.，and Jiang X.J.，
reactor的特点
2020, Analysis of the isolation and i- dentification of a phosphorus-accumulating bacterium and its characteristic of phosphorus removal, Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengw- uxue (Genomics and Applied Biology), 39(12): 5625-5630 (朱荣贵，方春玉，周健，明红梅，陈蒙恩，姚霞，邹月，姜秀娟，2〇2〇, 一株聚磷菌的分离、鉴定及其除磷特性分析，基因组学与应用生物学，39(12): 5625-5630)
5626基因组学与应用生物学
物除磷的一种机制，就是利用具有超量摄磷能力的 微生物来除磷(行智强等,2006)。
国内外在利用超量摄磷微生物除磷方面的研宄 广泛，研发和推广了多种微生物除磷工艺，但仍存诸 多问题未能解决。主要是污水环境中存在着聚磷菌 和其它微生物对有机碳源的竞争等因素，导致除磷 菌除磷效果通常不能达到最佳(邵闯等,2018)。因此，挖掘微生物除磷潜力，必须从挖掘新菌种和微生物 的除磷机理及特性方面进行研宄。
本研究针对原有污水处理系统中C A S S反应池 不能高效除磷问题，通过富集、分离、MOPS(1Ox)培 养，以及异染颗粒染实验筛选原有污泥中的高效 聚磷菌，检测其生长曲线，及其在不同pH、温度、时 间、微量元素添加量下的除磷率，为污水处理系统提 供备用菌种，同时为有针对性的调整工艺提供参考 数据，以保证除磷菌在水体生态中的优势地位，提高 废水处理系统中磷的处理效率。此外，研宄通过筛选 实验，初步了解其除磷机理，以期进一步对菌株进行 深度开发，最终实现除污系统的廉价高
效运行。
1结果与分析
1.1优势菌种的分离与纯化
经过富集、分离，从泸州老窖罗汉污水处理站 C A SS曝气池活性污泥内分离得到5株聚磷菌，编号 依次为:？1、？2、？3、？517。菌落为乳黄，不透明，边 缘不光滑，毛绒状。
1.2聚磷菌除磷能力检测
分别将5株菌进行液态发酵，对相同培养条件 下5株菌的除磷能力进行测定(图1)。P2的除磷能力 最强，除磷率可达85%，其余4株菌均在50%左右，因此选取P2做后续研宄。
^+P丨普P2 ★P3 ★P5 ♦P7
培养时间(h)
C u ltu re tim e (h)
图1不同培养时间对除磷率的影响
Figure 1 The effect of phosphorus removal bacteria rates under different culture time 1.3菌种形态、生理生化鉴定
观察P2菌株菌落形态和显微形态，其在MOPS 培养基上的纯化菌株在呈金黄（图2A)，菌体湿 润、易于挑取、无粘性，侧面观察为圆凸起状，显微 镜下观测其单菌株呈杆状；菌株革兰氏染呈阳性 (图2C)；对菌体做异染颗粒染（甲苯胺蓝染液)实 验，显微镜下观察到菌体内含有大量黑异染颗粒 (图2B)，可初步断定，其菌体具有把可溶磷转化成多 聚磷酸盐的能力。
对菌株P2做生理生化鉴定试验(表1)，根据这 些生理生化特性，结合分子鉴定，可以初步鉴定菌株。
1.4 16S rDNA序列测定及同源性分析
菌株提取D N A并扩增16S rDNA序列片段，对 扩增产物测序(上海杰李生物技术有限公司完成)，测
序结果在GenBank上进行B LA ST比对分析。通过 对比可知：株菌P2与多株已经报道的具有聚磷能力 的柠檬酸杆菌(Ci如6octersp.)的同源性大于99%。结
图2菌株P2形态
注:A：菌落;B：异染颗粒染(10x100); C：革兰氏染(10x100) Figure 2 Morphology of s t r a i n P2
Note: A: Colony; B: Metachromatic granules staining pattern (10x100); C: Gram sta i n(10x100)
表1 P2菌株的生理生化鉴定
Table 1 Physiological and biochemical identification of P2
项目
Item
结果
Result
项目
Item
结果
Result 革兰氏染+淀粉水解实验+ Gram staining Starch hydrolysis t e s t
荚膜染-过氧化氢实验-Capsules staining Hydrogen peroxide t e s t
芽孢染+吲哚实验-Spore staining Indole t e s t
V-P反应-明胶液化实验+
V-P reaction Gelatin liquefaction t e s t
甲基红实验-硝酸盐还原实验-Methyl red t e s t Nitrate reduction t e s t
注阳性或‘有”；阴性或“无”
Note: “Positive or have; “Negative or not
have
一株聚磷菌的分离、鉴定及其除磷特性分析5627
图5不同温度条件对高效聚磷菌除磷率的影响
Figure 5 The effect of phosphorus removal bacteria rates under
different temperature
91%，继续提高温度时，检测菌株除磷率大幅下降，升 至40°C 时，除磷率降至50%。可见菌株除磷效率对温 度比较敏感。过高的温度抑制菌株中参与除磷的酶 的活性，从而使其除磷率大幅下降。1.5.4不同培养时间对除磷率的影响
在不同培养时间下检测菌株的除磷率(图6)。培 养时间在12h 之内，培养时间与菌株除磷率呈正比 的线性关系，除磷率快速提升，在12 h 时达到实验时 间范围内的最高值89%, 12 h 后至30 h ，除磷率基本 稳定在86%左右。菌株除磷率的这种特性，其原因可 能是培养初期发酵液中CO D 含量较高，菌株除磷能 力得以发挥，随着培养时间的推移，CO D 含量急剧下 降，聚磷菌P 2无法过量吸收磷元素，甚至少数菌株 会出现释磷来获得能量，故其除磷率进入稳定期。整 体来看,P 2能在较低的C O D 环境下保持较高的除 磷率。
1.5.5不同微量元素添加量对除磷率的影响
不通过检测不同微量元素添加量下的除磷率 (图7)，在培养基中添加0~5mL /L 微量元素，从整体 上看，菌株P 2的除磷率先升高后降低，添加1 mL/L 微量元素时，菌株除磷率快速提高；添加2 mL /L 时，
除磷率继续提高但增速变缓，同时除磷率达到实验
图4不同初始p H 条件对高效聚磷菌除磷率的影响
Figure 4 The effect of phosphorus removal bacteria rates under different pH
图6不同时间对聚磷菌除磷率的影响
Figure 6 Effect of different times of the r ate of phosphorus re­moval bacteria
合对株菌P 2的形态观察、生理生化特性检测及微生 物学检测结果，菌株P 2属于朽1檬酸杆菌(FChem khao et  al ” 2012)。
1.5聚磷菌除磷特性1.5.1生长曲线的测定
P 2的生长曲线特征显示(图3)：经过缓慢生长 期(0〜6 h ), 24 h 后生长变慢，48 h 后进入稳定期，检
测其细胞浓度达到最大。作为种子液一般选择其快 速生长期，即丨2~24h 内接种为宜。观察曲线可知,P 2
稳定期在100 h 左右，说明其能在较低COD 浓度下 存活较长时间，适应外界环境能力较强。1.5.2初始pH 值对除磷率的影响
以5种pH 值(5~9)的5个初始培养基分别进行 发酵，观察各除磷率(图4)。在试验范围内，随着pH  值变大，P 2的除磷率先增大后减小，在pH 值为7附 近达到最大值。说明其除磷最适pH 值为7。过高或 过低的pH 值都影响其除磷效率。其可能的原因一是 菌株的生理活性受pH 值影响，非中性环境时，其活 性较差。二是除磷机制中的酶活性可能受到了抑制, 从而导致菌株除磷功能降低。1.5.3不同培养温度对除磷率的影响
使用不同温度进行发酵，分别检测其除磷率 (图5)。在初始升温阶段，菌株除磷率在76%附近，随 着温度提高，除磷率缓慢提高，在30°C 时达到峰值
图3聚磷菌生长曲线 Figure 3 Growth curve of PAOs
2(
10<8(6I 4(2(—
(％)
3
«J
一R J A O U I 3J
s n j o q d s o q
o .
<%)
齋
m
迓
h )
§
吨
me
时
Ti (％
)
a 2
I B A O E 3J
s r u o q c l s o q
a .
(％)讲
s #
(％)
s B J «>O E 3J  s r u o q d s o q
C L
(
％)齋铥
盤
5628基因组学与应用生物学
微量元素添加量(m L/L)
T ra ce ele m e n t ad d itio n (m lV L)
图7不同微量元素添加量对高效聚磷菌除磷率的影响
Figure 7 The effect of phosphorus removal bacteria rates under different trace elements
最大值76%；当微量元素为3 mL/L时，除磷率出现 急剧的下降，接近于未添加微量元素。继续增加微量 元素添加量，除磷率缓慢下降。实验结果可以看出，除鱗率对微量元素的含量比较敏感，适量的添加微 量元素，能够大幅提升菌株的除磷效果。
2讨论
本研宄筛选出了 5株具有聚磷能力的菌株，其 中一株(P2)除磷率可达到85%。目前研宂者发现聚磷 菌除磷率一般在50°/。~90%间，P2的除磷能力较高。通过分子及形态学、生理生化鉴定结果确定其属于 柠檬酸杆菌。目前研究发现的聚磷优势菌以不动杆 菌属为主，其它还包括气单胞菌属、假单胞菌属、微 球菌属、和链球菌属等，柠檬酸杆菌类较少。目前聚 磷菌的研究材料来源十分广泛，以污水处理系统居 多，但以C A SS反应池为菌株来源的研宂极少，其相 关研宄具有很强的应用价值。
针对污水处理过程中存在着聚磷菌和其它微生 物对有机碳源的竞争现象(邵闯等，2018)，研宄者对 此开展了诸多研究，多从了解菌株特性入手，调整工 艺及参数，但多数工艺优化效果有限。本研宄认为除 此方向以外，研究菌株除磷机理也是解决该问题的 一个好的切入点。
本研究对菌株的除磷特性进行了研究，其与相 关报道的菌株特性存在着不同程度的差异。研宄摸 清了其最佳除磷工艺条件，也通过筛选过程中的异 染颗粒染实验，了解了菌株的除磷机理，为该菌株 的开发应用提供了一些参考数据。但仍只是初步研 究，后续需要进一步利用分子生物学等手段对其机 理进行深入探讨，结合除磷特性的研宄，通过更加有 效的工艺改进，乃至生物工程手段改造菌株，来大幅 提尚除隣效率。3材料与方法
3.1材料
3.1.1实验材料
实验用污泥取自四川泸州老窖股份有限公司罗 汉污水处理站CA SS反应池。实验用水分两部分，一 部分为配制废水，一部分为泸州老窖股份有限公司 罗汉污水站中间水池污水。
3.1.2实验仪器
精密pH计、恒温高速离心机、化学需氧量速测 仪、总磷测定仪、生物显微成像系统、影像分析菌落 计数仪、PCR扩增仪、凝胶成像仪、DGGE电泳仪、DGGE凝胶进样器、超纯水仪等。
3.1.3培养基
富集培养基成分(陈亚松等，2011):(NH4)2S042.0 g，MgSO4.7H2O0.5g、无水乙酸钠 5_0g、CaCl20_2g、KH2PO42〜20 mg、蒸馆水至 1 000 mL、pH 值为 7.2~
7.4，培养基中磷酸二氢钾的含量梯度：2 mg、5 mg、
8 mg、10 mg、15 mg、20 mg。
分离培养基成分(陈亚松等，2011)：蛋白胨10 g、KH2P04 15 mg、牛肉膏 3 g、NaCl 5 g、琼月旨 15~20 g、蒸馏水1 000 mL、pH值为7.2〜7.4。
MOPS培养基(1Ox):tricine0.717 g,mops8.370 g、定 容到 44 mL、10 m ol/L KOH 调 pH 值为 7.4、0.01 mol/L FeS04 1mL，依次加入下列溶液：NH4CI (1.9 mol/L) 5mL,K2SO4(0276mol/L)1mL,CaCl：-2H20(0.02mol/L) 0.025 mL，MgCl2.6H20(25 mol/L)0_21mL,NaCI(5mol/L) 10 mL。
聚磷培养基：MgS04*7H20 82 mg、无水乙酸钠1.0g、(NH4)；；S〇40.2 g、微量元素 2 mL、K_H2P0474 mg、CaCl260 mg、蒸馆水 1 000 mL、pH 值为 7.0~7_2。
专性培养基:(NH4)2S040.2 g，MgS04*7H200.1g, CH,COONa 2.0 g,KH2P04 0.1 g,CaCl2 0.06 g.NaCl 0.5 g，微量元素2 mL，加水至1 000 mL,pH值为 7.0~7_2。
3.2实验方法
3.2.1检测方法
CODcr的测定方法:C O D快速测定仪测定；TP 的测定方法：钼酸铵分光光度法(参照GB11893-89) 测定总磷含量。pH的测定：精密pH计测定。菌体生
长密度的测定：浊度法
一株聚磷菌的分离、鉴定及其除磷特性分析5629
3.2.2聚磷菌的富集
从充分混匀的样品溶液中取出15 mL，注入含 150m L富集培养基的三角瓶中，在150r/min、30°C 的条件下振荡培养1〜3 d，待培养基混浊，吸取8 mL 培养液转移至富集培养基中，在相同样条件下继续 振荡培养1〜3d，如此反复4次，每次的转移量分别 为4 mL、2 mL、1mL、0.5 mL，且每次适当增加富集
培 养基中磷酸二氢钾的含量，其含量依次为:1 mL、2mL、4 mL、8 mL、15 mL、30 mg。
3.2.3菌落的分离
采用传统的稀释涂布法与平板划线法对富集的 菌种进行分离纯化。用移液将最终富集的菌悬液依 次稀释为1〇_2~1〇7倍。取不同梯度的菌悬液0.1mL 依次均匀涂布于7块相同的分离培养基上(3组平 行)，然后于相同的30°C恒温培箱内培养2~3 d。对单 菌落较多的平皿进行单菌落挑取，通过划线法接于 另一平皿中。转接2-4次，直到得到菌落特征完全一 致的单株菌落，然后转接试管斜面保存备用。
3.2.4高效聚磷菌筛选
将上述斜面保存的菌株点接于含有MOPS(1Ox)培养基的培养皿中,30°C下恒温培养1〜5d，此时观 察培养皿内出现蓝斑的菌株即为具有聚磷能力的菌 株(Morohoshi et al.，2003)。之后，对具有聚隣能力的 菌株进行异染颗粒染，菌株体内含有的异染颗粒 越多，表明所具有的聚磷能力越强，将聚磷能力较强 的菌株首先接入释磷培养基内，然后在30°C下厌氧 培养24 h；之后5 000 r/min离心5 min收集菌体；菌体用无菌水溶解后，转接于富磷培养基内，然后于 30°C、]50 r/min条件下好氧培养24 h，测定除磷率。
3.2.5聚磷菌的鉴定
形态、生理生化鉴定：将菌株的形态及生理生化 实验结果对照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏
细菌鉴定手册》，以鉴定菌株。
分子生物学鉴定：使用细菌基因组DNA提取 试剂盒进行D N A提取，PC R反应体系：DNA模版 1jxL；1OxBuffer5 |xL；dNTP4 (j l L；Mg2"3 j j l L；27 F1j j l L；1492 R 1 |x L；以酶丨 |x L;ddH2034 pL。
3.2.6聚磷菌特性
生长曲线的测定：将斜面保存菌种转接于专性 培养基中，在30°C、150 r/min摇床中好氧振荡培养 12 h。配制专性培养液分装于30个100 m L三角瓶 并灭菌，依次编号。分别取2 m L种子液，加入到30个三角瓶中，30°C、150 r/min好氧振荡培养。每6 h取 出一个三角瓶记录后并放入冰箱-20°C保存，培养结 束时所有时段培养基一同检测吸光值。浓度较大的 菌悬液可利用未接种的专性培养基进行适当稀释，以使其吸光度值在〇.丨〇~〇.65之间，将测得的吸光度 值乘以稀释倍数可得到该时间段的真实吸光度值。实验设置•组未接种的专性培养基作空白对照，对 不同时间的培养液从0 h起依次进行测定(OD^)。
高效聚磷菌除磷特性的研究：初始pH值除磷率 的影响(任南琪和陈鸣歧,2004)：配制5个pH分别为 5、6、7、8、9的培养基并分别装入250 m L三角瓶并 灭菌，每瓶接入5%种子液，放入30°C、150 r/min摇 床震荡培养12 h，其后检测各瓶的除磷率。
培养温度对除磷率的影响(2 429〜2 434)：配制培 养基并分装入5个250 m L三角瓶并灭菌，每瓶接入 5
%的种子液，5瓶培养基分别在温度20°C、25°C、3〇1；、35°(：、40°(：的摇床中15〇1'/111丨11振荡培养12 11，其后检测各瓶的除磷率。
培养时间对除磷率的影响：配制培养基并分装 入5个250 m L三角瓶并灭菌，每瓶接入5%的种子 液，将5瓶培养基放入30°C、150 r/m in的摇床中振 荡培养，分别培养6 h、12 h、18 h、24 h、30 h后依次取 出，检测各瓶的除磷率。
微量元素添加量对除磷率的影响：配制培养基 并分装入5个250m L三角瓶，并依次添加0、1mL/L、2 mL/L、3 mL/L、4 mL/L、5 mL/L浓度微量兀素，灭菌，每瓶接入5%的种子液，放入摇床中在30°C、150r/m in 条件的培养箱中振荡培养12 h，其后检测各瓶的除 磷率。
作者贡献
陈蒙恩、姚霞、邹月是本研究的实验设计者和实 验研究的执行人；方春玉、明红梅完成数据分析，论 文初稿的写作；周健参与实验设计，试验结果分析；朱荣贵、方春玉是项目的构思者及负责人，姜秀娟指 导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者 都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由酿酒及生物技术四川省重点实验室项 目(NJ2014-05)、泸州老窖科研奖学金项目（151jzk06)、
四川省教育厅项目（16ZB0244)、四川轻化工大学校

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。