QIIME2使⽤⽅法
激活qiime2的执⾏环境：source activate qiime2-2019.4
如何查看conda已有的环境：conda info -e
以下分析流程参考：/2019.4/tutorials/qiime2-for-experienced-microbiome-researchers/
1、数据准备
现在我们常⽤的就是这种格式的数据，每个样品⼀对数据⽂件
wget \
-O "casava-18-paired-end-demultiplexed.zip" \
"/2019.4/tutorials/importing/casava-18-paired-end-demultiplexed.zip"
下载解压后，⽂件夹中⽂件如下：
2、将数据转换为qza格式（qiime新定义的⾃⼰的格式类型，有点编程中对象的含义）
qiime tools import \
--type 'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]' \
--input-path casava-18-paired-end-demultiplexed \
--input-format CasavaOneEightSingleLanePerSampleDirFmt \
--output-path demux-paired-end.qza
3、查看数据质量
qiime demux summarize --i-data demux-paired-end.qza --o-visualization demux-summary-1.qzv
⽤以下命令查看结果：
qiime tools view demux-summary-1.qzv
4、双端序列合并成单端
qiime vsearch join-pairs --i-demultiplexed-seqs demux-paired-end.qza --o-joined-sequences demux-joinded.qza
5、查看对merge后的数据质量情况
qiime demux summarize --i-data demux-joinded.qza --o-visualization demux-summary-merged.qzv
qiime tools view demux-summary-merged.qzv
> 以下是使⽤dada2进⾏数据去噪，本教程先跳过该步，之后有专门教程介绍dada2使⽤
4、对数据进⾏剪切
双端：
qiime dada2 denoise-paired \
--i-demultiplexed-seqs demux-paired-end.qza \
--p-trim-left-f 13 \
--p-trim-left-r 13 \
--p-trunc-len-f 150 \
-
-p-trunc-len-r 150 \
--o-table table.qza \
--o-representative-sequences rep-seqs.qza \
--o-denoising-stats denoising-stats.qza
单端：
qiime dada2 denoise-single \
--i-demultiplexed-seqs demux-joinded.qza \ #输⼊应该也是序列，不能是joined对象
--p-trim-left 13 \
--p-trunc-len 150 \
--o-table table.qza \
--o-representative-sequences rep-seqs-merged.qza \
-
-o-denoising-stats denoising-stats-merged.qza
以下参考：
5、序列质控
qiime quality-filter q-score-joined \
--i-demux demux-joinded.qza \
--o-filtered-sequences demux-joined-filtered.qza \
--o-filter-stats demux-joined-filter-stats.qza
输出结果:
demux-joined-filter-stats.qza: 统计结果
demux-joined-filtered.qza: 数据过滤后结果
6、⽤deblur去冗余，并⽣成特征表（相当于QIIME1的OTU Table）
qiime deblur denoise-16S \
--i-demultiplexed-seqs demux-joined-filtered.qza \
--p-trim-length 250 \
--p-sample-stats \
--o-representative-sequences rep-seqs.qza \
--o-table table.qza \
--o-stats deblur-stats.qza
输出结果:
rep-seqs.qza: 代表序列
deblur-stats.qza: 统计过程
table.qza: 特征表
备注：
由于DADA2和Deblur产⽣的“OTU”是通过对唯⼀序列进⾏分组⽽创建的，因此这些OTU相当于来⾃QIIME 1的100%相似度的OTU，通常称为序列变体。在QIIME 2中，这些OTU⽐QIIME 1默认的97%相似度聚类的OTU具有更⾼的分辨率，并且它们具有更⾼的质量，因为这些质量控制步骤⽐QIIME 1中实现更好。因此，与QIIME 1相⽐，可以对样本的多样性和分类组成进⾏更准确的估计。
7、查看deblur去冗余后的特征表
qiime feature-table summarize \
--i-table table.qza \
--o-visualization table.qzv
--m-sample-metadata-file sample-metadata.tsv
qiime feature-table tabulate-seqs \
--i-data rep-seqs.qza \
-
-o-visualization rep-seqs.qzv
qiime tools view table.qzv
8、统计每个样品包含的序列数
qiime deblur visualize-stats \
--i-deblur-stats deblur-stats.qza \
--o-visualization deblur-stats.qzv
qiime tools view deblur-stats.qzv
9、构建进化树⽤于多样性分析
qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree \
--i-sequences rep-seqs.qza \
--o-alignment aligned-rep-seqs.qza \
-
-o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza \
--o-tree unrooted-tree.qza \
--o-rooted-tree rooted-tree.qza
11、计算核⼼多样性
qiime diversity core-metrics-phylogenetic \
--i-phylogeny rooted-tree.qza \
--i-table table.qza \
--p-sampling-depth 500 \
--m-metadata-file sample-metadata.tsv \
--output-dir core-metrics-results
分析结果包含：
α多样性
⾹农(Shannon’s)多样性指数（落丰富度的定量度量，即包括丰富度richness和均匀度evenness两个层⾯）
Observed OTUs（落丰富度的定性度量，只包括丰富度）
Faith’s系统发育多样性（包含特征之间的系统发育关系的落丰富度的定性度量）
均匀度（或 Pielou’s均匀度；落均匀度的度量）
β多样性
Jaccard距离（落差异的定性度量，即只考虑种类，不考虑丰度）
Bray-Curtis距离（落差异的定量度量）
⾮加权UniFrac距离（包含特征之间的系统发育关系的落差异定性度量）
加权UniFrac距离（包含特征之间的系统发育关系的落差异定量度量）
β多样性分析结果-PCoA：
12、Alpha多样性组间显著性分析和可视化
qiime diversity alpha-group-significance \
--i-alpha-diversity core-metrics-results/faith_pd_vector.qza \
--m-metadata-file sample-metadata.tsv \
--o-visualization core-metrics-results/faith-pd-group-significance.qzv
qiime diversity alpha-group-significance \
--i-alpha-diversity core-metrics-results/evenness_vector.qza \
--m-metadata-file sample-metadata.tsv \
--o-visualization core-metrics-results/evenness-group-significance.qzv
13、绘制稀疏曲线
qiime diversity alpha-rarefaction \
-
-i-table table.qza \
--i-phylogeny rooted-tree.qza \
--p-max-depth 1000 \
--m-metadata-file sample-metadata.tsv \
--o-visualization alpha-rarefaction.qzv
--p-max-depth参数的值应该通过查看上⾯创建的table.qzv⽂件中呈现的“每个样本的测序量”信息来确定。⼀般来说，选择⼀个在中位数附近的值似乎很好⽤。
14、物种组成分析
下载物种注释数据库制作的分类器：
wget \
-O "gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza" \
"/2018.11/common/gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza"
物种注释和可视化
qiime feature-classifier classify-sklearn \
--i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza \
tabletable--i-reads rep-seqs.qza \
--o-classification taxonomy.qza
qiime metadata tabulate \
--m-input-file taxonomy.qza \
--o-visualization taxonomy.qzv
⽣成物种组成柱状图：
qiime taxa barplot \
--i-table table.qza \
-
-i-taxonomy taxonomy.qza \
--m-metadata-file sample-metadata.tsv \ --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
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