HPLC-ELSD法测定酸
枣仁合剂提取物混合片剂中
酸枣仁皂苷A的含量
张凤鸿　上海中维检测技术有限公司　126707
摘要：建立了HPLC-ELSD分析酸枣仁合剂提取物混合片剂中酸枣仁皂苷A的含量的方法。采用：
Agilent XDB-C18, 柱温30℃，乙腈水梯度洗脱，梯度流速，程序进样，ELSD蒸发温度90℃，雾化
器温度：85℃。实验结果：酸枣仁皂苷A在20.00-100.00ug/ml范围内线性良好（R² = 0.9971），仪
器精密度1.2%，方法精密度2.2%，平均回收率在99.8%-105.9%，系统适应性中样品中酸枣仁皂苷
A 的分离度为2.2，理论塔板数74459，专属性良好，检出限为5ug/mL，对应的样品浓度为50mg/kg
（0.005%），定量限为10ug/mL，对应的样品浓度为100 mg/kg （0.010%）。结论：采用HPLC-ELSD方
法，对枣仁合剂提取物混合片剂中酸枣仁皂苷A的含量进行测定，操作简单，准确性高、重复性好适
合于酸枣仁合剂提取物混合片剂中酸枣仁皂苷A的含量的测定。
酸枣仁皂苷来源于为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill. var.spinosa (Bunge) H u ex H. F. Chou干燥成熟的种子，具有养心补肝，宁心安神，敛汗，生津。用于虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴的功效[1]。酸枣仁合剂收录于卫生部药品标准中药成方制剂第七册，由酸枣仁、知母、茯苓、川芎和甘草五味中草药构成[2]，但由于煎煮程序复杂，因此部分药厂将这五味或是取其部分中草药或与其他中草药配伍做成特殊膳食补充剂，方便服用。其中起主要药效的是酸枣仁皂苷A，目前对于酸枣仁皂苷A的检测多是集中在单味药酸枣仁及其提取物的检测，利用HPLC[1,3,4]，以及LC-MS-MS方法[5]，然而没有对于酸枣仁合剂及复方中酸枣仁皂苷A的检测方法，本实验的主要目的是利用HPLC-ELSD建立酸枣仁合剂提取物混合片中酸枣仁皂苷A含量的测试方法。
1仪器、试剂和样品信息
高效液相谱仪：安捷伦HPLC 1260-安捷伦蒸发光散射检测器380(ELSD)
电子天平：梅特勒XS205DU十万分之一天平
恒温振荡水槽：上海一恒，DKZ电热恒温振荡水槽
氮吹仪：安谱，40位tablet5
酸枣仁皂苷A ：安谱，98.8%
甲醇： CNW，纯度：99.9%，级别：HPLC
乙腈： J&K 纯度：99.9% 级别：ACS/HPLC
水：Merck Millipore制备的超纯水
过滤膜：安谱，0.45µm有机滤膜
样品信息：混合提取物片剂（酸枣仁提取物+知母提取物+茯苓提取物+川芎提取物+甘草提取物+辅料（麦芽糊精+玉米淀粉等）)，客户提供，配比保密。
样品空白信息：混合提取物片剂（知母提取物+茯苓提取物+川芎提取物+甘草提取物+辅料（麦芽糊精+玉米淀粉等），客户提供，配比保密。
2方法与结果
2.1测试条件
仪器名称：液相谱质谱仪（安捷伦1260-蒸发光散射检测器（ELSD））
谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18, 4.6×250 mm, 5µm
谱条件：
柱温：30°C
流动相A：18MΩ超纯水
流动相
B：谱纯乙腈（ACN）
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DEC. 2020
CFI
时间/min流动相A流动相B流速ml/min
0-1580→6020→40  1.0
15-176040  1.0
17-2360→040→100  1.0→2.0
23-280100  2.0
28-320→80100→20  2.0→1.0
进样程序：吸取速度200µl/min，进样速度200µl/min，吸取样品量50µl，吸取水量50µl，进样环内混合10次，进样。
蒸发光散射ELSD检测器参数：
蒸发温度：90°C
雾化器温度：85°C
氮气流速：1.6 SLM
2.2方法学验证结果
2.2.1标准品贮备液制备
称取酸枣仁皂苷A（ANPEL，98.8%，P1860010）10.45 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度。制得浓度为1032µg/mL的标准储备液待用。
2.2.2样品前处理
样品用食品破碎机打碎，称取1.00克于40mL 玻璃瓶中，加入10mL70%的甲醇水溶液，混匀后，旋紧螺纹盖密封，置于85°C水浴中加热并振荡2h。加热完毕后，冷却至室温。精确取1.00mL 样品溶液于氮吹管中，50°C吹至近干，精确加入1.00mL甲醇复溶，过0.45µm有机滤膜，50µL程序进样，HPLC-ELSD分析。
2.2.3系统适用性
取酸枣仁皂苷A 20 µg/mL线性低点溶液，进样分析，评价其理论塔板数为74459，结果详见表6。
2.2.4线性关系试验
标准曲线溶液配制与测试：分别用微量移液器，移取19.3µL、38.8µL、58.1µL、79.5µL、96.9µL酸枣仁皂苷A标准储备溶液（1032µg/mL），加入相应体积的甲醇，得到1mL的标准曲线溶液，混匀后，进样分析。以面积的对数与含量的对数拟合直线方程，得Y = 0.6124*X - 0.1448，相关系数R² = 0.9971。
检测结果见下表1。
2.2.5重复性试验
A：方法精密度：按照“2.2.2样品前处理”进行样品制备，独立制备6份，计算6次独立制备样品的重复性RSD%。
B: 仪器精密度：取酸枣仁皂苷A标准溶液100 µg/mL溶液，进样6次，计算酸枣仁皂苷A面积的RSD%。
试验结果见表2。
2.2.6加标回收率试验（准确度）
样品制备：样品制备同“2.3.2样品前处理”
加标样品制备：称取1.00克于40mL玻璃瓶中，独立称取9份，分别按照酸枣仁皂苷A理论含量0.027%进
行约0.5倍、1倍、1.5倍的加标，每个水平三份样品，然后按照“2.3.2样品前处理”。具体加标浓度及结果见下表3。
2.2.7检出限与定量限试验
取酸枣仁皂苷A低点浓度溶液（20µg/mL），用上述仪器方法进行HPLC-ELSD分析，在保留时间处截取一段基线，以目标物峰的响应与杂质的响应求算信噪比（S/N），以此S/N之值线性推算检出限与定量限。
取酸枣仁皂苷A 20µg/mL浓度溶液，用甲醇进行1:1稀释，得到10µg/mL酸枣仁皂苷A标准溶液，进样分析后，实际S/N=13.8。取酸枣仁皂苷A 10µg/mL浓度溶液，用甲醇进行1:1稀释，得到5 µg/mL酸枣仁皂苷A标准溶液，进样分析后，实际 S/N=3.7。
检测结果见表4。
因此，结合实际逐级稀释后的实验结果，检测限：酸枣仁皂苷A仪器检出限为5ug/mL，对应的样品浓度为50mg/kg（0.005%），酸枣仁皂苷A的定量限为10ug/mL，对应的样品浓度为100 mg/kg （0.010%）。
2.2.8专属性试验
样品空白制备：称取1.00克的样品空白样，按照“2.2.2样品前处理”处理样品，上机分析，考察是否存在干扰，见典型谱图1。
样品制备：称取1.00克的样品，按照“2.2.2样品前处理”处理样品，上机分析，考察是否存在干扰及分离度，见典型谱图2及详见下表7。
从空白样品谱图及实际样品谱图分析，空白样品在酸枣仁皂苷A处无干扰，实际样品酸枣仁皂苷A的分离度达到2.2
3讨论
本实验之所以采用程序进样，是因为样品用
1ml
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CFI
备注：样品中酸枣仁皂苷A 实际的含量为0.0274%
谱图1
甲醇复溶后，直接甲醇进样时，可能是由于进样溶剂强度远大于流动相起始强度，导致峰型变差，精密度变差。而直接采用50%甲醇水复溶时，由于极性较大，杂质过多，专属性变差。因此采用进样程序，进样环内加入1体积水来混合，解决了上述问题，且重现性和精密度良好。
结语
通过对方法适用性、线性、精密度、准确度、检出限、定量限和专属性考察。采用HPLC-ELSD方法，对枣仁合剂提取物混合片剂中酸枣仁皂苷A的含量进行测定，操作简单，准确性高、重复性好，适合于酸枣仁合剂提取物混合片剂中酸枣仁皂苷A的含量的测定，也可尝试酸枣仁皂苷A的其他混合提取物的测试。
参考文献
[1]酸枣仁，中国药典委员会，中国药典2015年版
[2]酸枣仁合剂，中华人民共和国卫生部，卫生部药品标准中药成方制剂第七册，标准编号：WS3-B-1458-93
[3]HPLC-ELSD法测定酸枣仁提取物中酸枣仁皂苷A和B，房杰，刘智宇等，《天然产物分离》2004年 第4期
[4]酸枣仁颗粒中酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的含量测定，周庆武，李玲玲，纪标等，药物鉴定，2007年第16卷第17期。
[5]HPLC-MS-MS法同时测定酸枣仁分散片中酸枣仁皂苷
A、酸枣仁皂苷
B、斯皮诺素的含量，马桂劼；张婷；解军波等，《食品科学》
2013年22期谱图2
缝对接”，促进产学研用产生最大效能值[1]。
3.4创新服务模式，共建共享平台资源
大冶市公共检验检测中心于2016年5月成立，用于食品检测实验室面积有1000余平方，设有理化检测大厅、质谱室、谱室、光谱室、微生物室、PCR 检测室等，采用了集中供气、人机分离等先进设计理念。配备的仪器设备有气相谱质谱联用仪、气相谱、高效液相谱、荧光定量PCR等100余台，价值800余万。目前，大冶市大部分食品企业实验室条件、设备较为简陋，无法为企业产品高质量发展提
供精准的技术支撑，所以，大冶市公共检验检测中心可以实行资源共享的新模式，让企业技术人员预约共享实验室设备设施，以期达到提升产品质量的目标。
结语
食品产业高质量发展已成为全国地域综合实力竞争的重要指标，检验检测工作在食品产业高质量发展中发挥着重要作用。结合大冶市检验检测服务食品产业发展现状，研究分析了当前存在的主要问题，并为充分发挥检验检测优势，深度挖掘潜力，推动食品产业高质量发展提出了切实可行的建议。
参考文献
[1]董占伟.服务产业高质量发展需要角担当[J].中国质量技术监督;2019年02期
（上接第113页）
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