收稿日期:2020-04-03  修回日期:2020-05-11
基金项目：浙江树人大学人才引进基金项目(N o .2019R 024)；浙江省151人才工程第一层次项目
*通讯作者：雷美康，男，硕士，高级工程师，研究方向：食品和药品质量安全.E -m a i l :l e i m e i k a n g
@163.c o m 第37卷第2期V o l .37 N o .2
分析科学学报
J O U R N A LO FA N A L Y T I C A LS C I E N C E
2021年4月
A p
r .2021D O I :10.13526/j
.i s s n .1006-6144.2021.02.022气相谱-质谱法测定药品中克霉唑的含量韩 超1，胡贝贞2，胡 侠3，王石磊1，沈 燕1，雷美康*
4
(1.浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江杭州310015;
2.绍兴海关综合技术服务中心，浙江绍兴312000;
3.联勤保障906医院，浙江温州325000;
4.杭州海关技术中心，浙江杭州310016
)摘 要：建立了气相谱-质谱法测定药品中克霉唑含量的分析方法㊂采用D B -35M S 谱柱(30mˑ0.25m mˑ0.25μm )
进行分离，质谱以选择离子模式进行检测，同位素内标法定量㊂在优化的条件下，克霉唑在0.05~5.0μg /m L 范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9997㊂样品加标平均回收率为91.1%~97.2%，相对标准偏差不大于6.5%㊂本方法简便㊁快速，灵敏度高㊁准确性好，可用于药品中克霉唑含量的测定㊂
关键词：克霉唑；药品；气相谱-质谱法；同位素内标中图分类号:O 657.63  文献标识码:A    文章编号:1006-6144(2021)02-264-05
克霉唑为咪唑类广谱抗真菌药，是真菌感染疾病的合成抗菌药，对多种真菌尤其是白念珠菌具
有较好的抗菌作用[1,2]㊂以往药品中克霉唑的测定主要采用的是高效液相谱法[3-6
]，但由于药品基体复杂，采用液相谱法测定缺乏克霉唑分子量信息，在定性方面存在不足，影响含克霉唑药物的质量控制㊂谱与质谱联用技术测定克霉唑报道较少，且主要集中在环境和食品中的克霉唑残留检测[
7,8]
㊂气相谱-质谱法具有分析时间短㊁分离效果好㊁定性准确等优势，已经在相关药品质量控制中得到了广泛应用[
9-12]
㊂本文建立气相谱-质谱法测定药品中克霉唑的含量，同位素内标法定量，方法快速㊁简便㊁准确，可用于含克霉唑药品的质量控制㊂
1 实验部分
1.1 仪器㊁
材料与试剂7890A -5975C 气相谱-质谱联用仪(美国，安捷伦公司);E l m aP300H 超声波清洗器(德国,E l m a 公司);M S 3b a s i c 涡旋振荡器(I K A 公司)；分析天平(梅特勒-托利多公司)㊂克霉唑标准品(纯度99.9%,C A S 23593-75-1)由德国D r .E h r e n s t o r f e rG m b H 提供，克霉唑-d 5(
纯度99.0%)由加拿大C D N 公司提供㊂丙酮㊁乙腈㊁甲醇㊁乙酸乙酯㊁环己烷均为谱纯(美国F i s h e r
S c i e n t i f i c
)㊂1.2 标准溶液配制
取克霉唑标准品10m g ，用乙腈溶解并转移至100m L 容量瓶中，用乙腈定容，配制100μg /m L 克霉唑标准储备溶液㊂取克霉唑-d 5标准品1m g
，用乙腈溶解并转移至10m L 容量瓶中，用乙腈定容，配制100μg /m L 克霉唑-d 5标准储备溶液㊂用乙腈逐级稀释，配成0.05㊁0.1㊁0.2㊁1.0㊁5.0μg /m L 的系列浓度4
62
第2期分析科学学报第37卷标准曲线溶液，其中克霉唑-d5同位素内标溶液浓度均为0.2μg/m L㊂
1.3样品制备
1.3.1含有克霉唑的片剂㊁乳膏和凝胶样品制备和提取取一片含有克霉唑的片剂用水溶解并定容至500m L；称取1.0g含有克霉唑的乳膏，含有克霉唑的凝胶取一支，分别用水溶解并定容至30m L㊂各取1m L上述液体，加入5m L乙腈提取，再加入1g N a C l盐析，静置分层，移取乙腈层至10m L刻度离心管中，下层再加入5m L乙腈进行提取，合并提取层于10m L刻度离心管中并用乙腈定容至10m L㊂取上述定容液10μL于10m L容量瓶中，加入100μg/m L克霉唑-d5标准储备溶液20μL，用乙腈定容至10m L，制得待测样品溶液，供气相谱-质谱测定㊂
1.3.2含有克霉唑的栓剂样品制备和提取取含有克霉唑的栓剂一枚，用乙酸乙酯ʒ环己烷(1ʒ1,V/V)溶解并定容至100m L㊂取10μL上述液体，置于10m L容量瓶中，加入100μg/m L克霉唑-d5标准储备溶液20μL，用乙腈定容至10m L，制得待测样品溶液，供气相谱-质谱测定㊂
1.3.3含有克霉唑的溶液样品的制备和提取取1m L含有克霉唑的溶液，加甲醇稀释并定容至10m L㊂取10μL上述液体，于10m L容量瓶中，加入100μg/m L克霉唑-d5标准储备溶液20μL，用乙腈定容至10m L，制得待测样品溶液，供气相谱-质谱测定㊂
1.4气相谱-质谱条件
1.4.1气相谱条件 D B-35M S谱柱(30mˑ0.25m mˑ0.25μm)，程序升温：初温60ħ，保持1m i n，以30ħ/m i n升至200ħ，再以15ħ/m i n升至300ħ，保持5m i n㊂载气为氦气(纯度ȡ99. 999%)，流速1.0m L/m i n，进样口温度260ħ，不分流进样，进样量1μL㊂
1.4.2质谱条件离子源温度300ħ，传输线温度310ħ，四极杆温度180ħ，溶剂延迟5m i n㊂E I电离模式，电离能70e V㊂监测模式：全扫描(S C A N)和选择离子监测(S I M)模式同时进行,S C A N扫描范围m/z50~400,S I M监测离子m/z165㊁243㊁278，其中定量离子为m/z165，克霉唑-d5监测离子m/z170㊁248㊁283，其中定量离子为m/z283㊂
2结果与讨论
2.1质谱参数的优化
在E I电离源下，对10m g/L的克霉唑及克霉唑-d5标准溶液分别进行一级质谱全扫描，得到每个目标物的全扫描谱图，见图1㊂选择丰度最强的三个离子作为定性离子，选择丰度最强的离子作为定量离子，克霉唑定性离子为m/z165.1㊁243.2㊁278.1，定量离子为m/z165.1；克霉唑-d5定性离子为m/z170.1㊁
图1克霉唑(A)及克霉唑-d5(B)的全扫描质谱图
F i g.1F u l l s c a nm a s s s p e c t r o g r a m s o f c l o t r i m a z o l e(A)a n d c l o t r i m a z o l e-d5(
B)
562
第2期韩超等：气相谱-质谱法测定药品中克霉唑的含量第37卷248.2㊁283.1，定量离子为m/z283.1㊂选择离子监测谱图见图2㊂
图20.2μg/m L的克霉唑(A)及克霉唑-d5(B)标准溶液的选择离子谱图
F i g.2S e l e c t i v e i o nm o d e c h r o m a t o g r a m s o f c l o t r i m a z o l e(A)a n d c l o t r i m a z o l e-d5(B)
s t a n d a r d s o l u t i o n(0.2μg/m L)
2.2提取条件的优化
根据不同药品类型，分别采用不同溶剂进行快速有效提取㊂不同类型的药剂(片剂㊁溶液㊁乳膏㊁栓剂㊁凝胶)含有不同的辅料，需要用不同的溶剂先溶解样品以获得澄清的液体，使所含的克霉唑均匀分布在溶剂中，才能进行下一步的提取㊂本实验根据不同类型的药剂，选取了含克霉唑的片剂㊁溶液㊁乳膏㊁栓剂㊁凝胶5种常见的药品，根据其所含的辅料不同，选取水㊁甲醇或乙酸乙酯ʒ环己烷(1ʒ1,V/V)预溶解样
品㊂采用有机溶剂溶解的样品经乙腈稀释一定倍数后直接供气相谱-质谱测定，采用水溶解的样品用乙腈反萃取其中的克霉唑，然后稀释一定倍数后供气相谱-质谱测定㊂
2.3方法学考察
2.3.1线性关系取 1.2 方法制备的0.05㊁0.1㊁0.2㊁1.0㊁5.0μg/m L系列标准工作溶液进行上机测定，以克霉唑与克霉唑-d5的峰面积比值为纵坐标(Y)，克霉唑与克霉唑-d5的质量浓度之比为横坐标(X)绘制标准曲线，同位素内标法定量㊂结果表明，在0.05~5.0μg/m L浓度范围内，克霉唑线性关系良好，回归方程为:Y=0.285+2.364X，相关系数(r2)为0.9997㊂
2.3.2稳定性考察取同一份样品溶液，在室温下放置0㊁4㊁8㊁16㊁24h后进气相谱-质谱分析，测定峰面积，克霉唑峰面积的相对标准偏差(R S D)为4.3%，表明样品溶液在24h内稳定性良好㊂
2.3.3精密度试验取按照 1.2 方法制备克霉唑标准品溶液，分别配制成高㊁中㊁低3种不同浓度(5㊁0. 2㊁0.05μg/m L)的溶液，按照 1.4 气相谱-质谱条件连续进样6次，测定峰面积，克霉唑峰面积的R S D 为4.6%㊂
2.3.4重复性试验精密称取同一批片剂药品6份，按照 1.3 方法制备供试品溶液，分别进行气相谱-质谱测定,R S D为4.2%，表明重复性良好㊂
2.3.5回收率与精密度对各个类型样品进行加标回收率实验，结果见表1㊂测得克霉唑的回收率在91.1%~97.2%之间,R S D为3.8%~6.5%㊂
表1加标回收率和R S D结果
T a b l e1R e s u l t s o f r e c o v e r y a n dR S D
T y p e s o f d r u g s C o n t e n t
(μg)R e c o v e r y
(%,n=6)
(%)R S D
(μg)S p i k e d
(μg)D e t e r m i n e d
T a b l e t6.110.015.3792.74.3
C r e a m11.010.020.4494.46.5
G e l7.810.016.9191.15.1
S u p p o s i t o r y10.510.020.1596.53.8
S o l u t i o n11.910.021.6297.24.2
2.4样品测定
应用本方法对市面药店里随机购买的含有克霉唑的药品进行分析，所得结果列于表2㊂检测结果和各种剂型的标示量相比相差不大，代表性样品里克霉唑的全扫描总离子图和定性全扫描质谱图见图3㊂662
第2期分析科学学报第37卷
表2药品中克霉唑含量
T a b l e2C o n t e n t s o f c l o t r i m a z o l e i n t h e d r u g
T y p e s o f d r u g s D e t e c t e d c o n t e n t L a b e l e d c o n t e n t D e v i a t i o n(%)
T a b l e t610m g/t a b l e t600m g/t a b l e t1.67
C r e a m33m g/g30m g/g10.0
G e l78m g/g e l100m g/g e l-22.0
S u p p o s i t o r y105m g/s u p p o s i t o r y150m g/s u p p o s i t o r y-30.0
S o l u t i o n11.9m g/m L15m g/m L-20.7
图3含克霉唑的代表性样品全扫描谱图(A)和定性全扫描质谱图(B)
F i g.3F u l l S C A Nc h r o m a t o g r a m(A)a n dS C A N m a s s s p e c t r o g r a m(B)o f r e p r e s e n t a t i v e s a m p l e s c o n t a i n i n g c l o t r i m a z o l e 3结论
本文建立了同位素稀释，气相谱-质谱法测定药品中克霉唑含量的方法㊂本方法针对不同药品的剂型和所含辅料不同，优化了前处理条件，方法前处理简单㊁精密度及准确性好和灵敏度高，可为含克霉唑药品的安全监测提供技术支持㊂
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D e t e r m i n a t i o no fC l o t r i m a z o l e i nD r u g s b y
G a sC h r o m a t o g r a p h y-M a s s S p e c t r o m e t r y
H A NC h a o1,HU B e i z h e n2,HU X i a3,WA N GS h i l e i1,
S H E N Y a n1,L E IM e i k a n g*4
(1.C o l l e g e o f B i o l o g y a n dE n v i r o n m e n t a lE n g i n e e r i n g,Z h e j i a n g S h u r e nU n i v e r s i t y,H a n g z h o u310015;
2.C o m p r e h e n s i v eT e c h n i c a lS e r v i c eC e n t e r o f S h a o x i n g C u s t o m s,S h a o x i n g312000;
3.T h e906t hH o s p i t a l o f C h i n e s eP L A,W e n z h o u325000;
4.T e c h n i c a l C e n t e r o f H a n g z h o uC u s t o m s,H a n g z h o u310016)
A b s t r a c t:A g a s c h r o m a t o g r a p h y c o u p l e dw i t hm a s s s p e c t r o m e t r y(G C-M S)
m e t h o dw a s d e v e l o p e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o no f c l o t r i m a z o l e i nd r u g.D B-35M Sc h r o m a t o g r a p h i c c o l u m n(30mˑ0.25m mˑ0.25μm) w a s u s e d f o r s e p a r a t i o n.S a m p l e sw e r e a n a l y z e d i n s e l e c t i v e i o nm o d e(S I M),a n d i s o t o p e i n t e r n a l s t a n d a r d m e t h o d w a s u s e d f o r q u a n t i f i c a t i o n.U n d e r o p t i m i z e d c o n d i t i o n s,t h e r e w a s a g o o d l i n e a r i t y f o r c l o t r i m a z o l e i n t h e r a n g e o f0.05-5.0μg/m L w i t ha c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t(r2)o f0.9997.T h ea v e r a g e r e c o v e r i e sw e r e91.1%-97.2%w i t ht h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nl e s st h a n6.5%.T h i s m e t h o di s s i m p l e,r a p i d,s e n s i t i v e a n d a c c u r a t e,a n d c a nb eu s e d t od e t e r m i n e t h e c o n t e n t o f c l o t r i m a z o l e i nd r u g s. K e y w o r d s:C l o t r i m a z o l e;D r u g;G a s c h r o m a t o g r a p h y-m a s s s p e c t r o m e t r y;I s o t o p e i n t e r n a l s t a n d a r d
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