对乙酰氨基酚片剂的相对生物利用度的测定
一、实验目的
1. 掌握尿药法测定相对生物利用度的实验设计与方法
2. 了解尿药法的特点和对乙酰氨基酚的体内过程
二、实验原理
对乙酰氨基酚在体内以原型（约5%）及葡萄糖醛酸结合物（55%~75%）和硫酸结合物（20%~40%）自尿中排出。因此，可采用尿药法测定生物利用度，其测定原理是对乙酰氨基酚及其代谢物水解成对氨基酚，对氨基酚在次氯酸钠的存在下与百里酚产生反应，生成蓝染料，此染料在601nm的波长处有最大吸收。
生物利用度是指药物或制剂服用后，主药到达大循环的相对数量和速度。它是药物制剂的质量的重要指标。绝对生物利用度的测定以静脉注射剂作为标准参比制剂，相对生物利用度常采用口服溶液剂，或市场认可、吸收较好且临床有效的制剂作为标准参比制剂。在评价生物利用度的参数中，相对生物利用度常用AUC或尿药排泄总量的相对比值Fr来反映吸收程度。
尿药数据法与血药浓度法一样，可以通过给药后收集各时间的尿样，经测定后拟合出动力学参数以及生物利用度数据。尿药法要求有较多的原形药物从尿中排出，并且药物的肾排泄过程符合一级速度过程。单室模型口服给药尿药法基本公式为：
式中，X0是给药剂量；F为生物利用度；ka为表观一级吸收速度常数；X为体内药量；k为一级消除速度常数；X与Xu为t时间体内药量与排泄于尿中的原形药物累积；ke为肾排泄速度常数。
当时间趋向无穷大时，后面一项相对于前面一项可以忽略不计，即变为单指数方程。取对数，并以平均尿药速度代替瞬时速度，以集尿中点时间t中代替t,则得到下式：
因此，给药后收集尿样，以对中作图得一曲线，由末端直线斜率可求出，并可计算出。
总排泄药量
相对生物利用度＝
三、仪器与材料
器材：分光光度计，电热套，具塞量筒，容量瓶，移液管，量筒
试剂：百里酚，4%次氯酸钠，10%氢氧化钠，对乙酰氨基酚（标准品，片剂，混悬液）
四、实验内容
（一）服药方案及注意事项
（1）受试者早上6:30起床，排出隔夜尿，喝水250mL。禁食早餐。6:50采集尿样约80mL做空白尿样(无需记录总体积)，供作标准曲线及其参比溶液用。
（2）7:00用200mL温开水吞服0.5g对乙酰氨基酚一片或约相当于对乙酰氨基酚0.5g的混悬剂剂数毫升，分别于8、9、11、13、15、17、19、21时分别采集所有尿液于量筒，记录体
积，取其中约50m置于加盖小瓶内，置冰箱保存备用。
注意事项：对乙酰氨基酚混悬液或片剂各有两名尿样提供者，服药前48h内禁服含对乙酰氨基酚类药物，服药者需禁食早餐，同时各服药者的午餐和晚餐应做到饮食一致，取样期间可适当喝水，但每次不超过200mL，并避免在取样前30min内喝水。
容器应贴上标签，注明样品编号、提供者代码以及药品代码，比如服用片剂（混悬剂）的提供者A，服药1h后的尿样标号为P1A（H1A）。提供者之间相互配合，提醒取样时间。
（二）显剂配制
1. 0.5%百里酚溶液试剂  称取百里酚0.5g，溶于10%氢氧化钠100mL，置棕瓶保存得试剂（1）。
2. 0.04%次氯酸钠溶液： 量取4%次氯酸钠溶液1mL，加水至100mL得试剂（2）。
3. 显剂（临用前配制）量取试剂 (1) 10mL，加入试剂（2）0.6mL，混匀即得。
（三）尿药标准曲线制作
1．储备液配制：精密称定105℃干燥至恒重的对乙酰氨基酚0.5g，用热蒸馏水于100mL容量瓶中溶解，冷却至室温后定容，得浓度为5mg/mL储备溶液。
2．标准溶液配制：分别精密吸取储备液0.5，1，2 ，3 ，4 ，5mL于50mL容量瓶中，加蒸馏水定容，得浓度分别为50，100，200，300，400，500µg/mL标准溶液。
3．绘制标准曲线：分别精密吸取上述浓度标准溶液各1mL（另取蒸馏水1mL，其余处理相同，作为参比溶液）于25 mL具塞试管中，分别加入空白尿液1mL、4moL/L HCL 4mL，水浴煮沸水解1h，取出冷却至室温，加蒸馏水至25mL，混匀。
精密吸取上述水解液3mL于10mL具塞EP试管，加蒸馏水2mL，显剂1mL，混匀，放置10min后于601nm波长处测定吸收度（1h内完成测定）。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并求出回归方程。
（四）尿药浓度测定
精密吸取样品尿液1mL（混悬液或片剂）（另取蒸馏水1mL，其余处理相同，作为参比溶液），加蒸馏水1mL， 4moL/L HCL 4mL，水浴煮沸水解1h，取出冷却至室温，加蒸馏水至
25mL，混匀。
精密吸取样品尿液的水解液3mL于10mL具塞EP试管，加蒸馏水2mL，显剂1mL，混匀，放置10min后于601nm波长处测定吸收度（1h内完成测定），记录结果。
五、实验结果
1．绘制标准曲线，并求出标准曲线回归方程。
表1标准曲线数据
编号
1
2
3
4
5
6
标准浓度 (µg/mL)
50
100
200
300
400
500
吸光度(A601)
回归方程
2．根据回归方程计算出各样品尿药浓度，记入表2。         
表2  尿药浓度数据处理
tablet2
时间
(h)
(h)
t中
(h)
尿药浓度(µg/mL)
(µg)
0
1
2
4
6
8
10
12
14
=                            ＝
3． 以对中作图得一曲线，由末端直线斜率可求出，再求出总排泄药量 。
4．将各小组混悬液或片剂的数据汇总，求出相对生物利用度。
六、思考题
1．尿药法测定相对生物利用度的特点和局限性有哪些？
2．影响实验结果的主要因素有哪些？

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