中国生物工程杂志China Biotechnology,2021，41 (4) :3746
D O I：10. 13523/j.c b. 2012054
引入新型异戊二烯醇利用途径促进解脂耶氏酵母中
P-胡萝卜素的合成
朱航志1蒋珊1陈丹2刘鹏阳1万霞u’4”
(丨中国农业科学院油料作物研究所武汉430062 2武汉工程大学化工与制药学院武汉430205) (3农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室武汉430062 4农业农村部油料加工重点实验室武汉430062)
摘要目的：微生物体内异戌二烯类化合物的前体物异戊烯焦磷酸酯的天然合成路径受到严格的代谢调控，因此限制了异戌二烯类化合物的高效生物合成，而新型异戊二烯醇利用途径独立于生物体内源性代谢路径，通过在微生物中引入IU P能够进行异戊烯焦磷酸酯的大量合成，从而促进异戌二烯类化合物的大量合成。方法：在油脂酵母解脂耶氏酵母中引入IUP，强化异戊烯焦磷酸酯生物合成，促进P-胡萝卜素的高效积累。结果：通过生物信息学的方法预测I U P中两个关键蛋白酿酒酵母来源的胆碱激酶S c C K和拟南齐来源的异戊烯磷酸激酶AtIPK，均为酸性亲水性蛋白，无跨膜区和信号肽，二者都具有疏松不稳定的结构特征，显著富集于磷酸类物质的合成通路中。在解脂耶氏酵母中利用同源重组技术引入外源p-胡萝卜素合
成关键基因car/W和m rB，强化甲羟戌酸途径的关键基因和保s/，使工程菌株中积累2.68 mg/L p-胡萝卜素。通过Cre-lo x P系统回收基因组上的u m标签，再将IU P进一步整合到工程菌株染体上。当培养基中含有20 m M异戌二烯醇作为底物、碳氮比为4/3且发酵96 h后，重组解脂耶氏酵母中(3-胡萝卜素的产量提高到410.2 mg/L，较原 始工程菌的产量提高了近200倍。结论:IU P能够促进解脂耶氏酵母中p-胡萝卜素的高效积累，为利用IU P开展p-胡萝卜素和其他异戌二烯类化合物的高效生物合成提供新思路。
关键词异戌二烯醇利用途径（IUP)异戌烯焦磷酸酯（3-胡萝卜素解脂耶氏酵母
中图分类号Q939
异戊二烯类化合物（isoprenoids)广泛的存在于自 然界的生物体中，目前已经发现的种类超过50 000 种、P-胡萝卜素（P-carotene，BC)是最重要的异戊 二烯类化合物之一，属于萜类物质，是维生素A的合成 前体，被联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂 联合委员会（JECFA)确认为A类优秀营养素，现已 经广泛的应用于药品、食品、化妆品和保健品，具有很 高的商业价值，2020年全球BC产业规模超过3亿美 元[W]。为满足市场对B C日益增长的需求，同时解决 工业生产对环境造成的压力，利用合成生物学结合代收稿日期:2020-丨2-25 修回日期:202142观
*中国农业科学院基础前沿培育项目（Y2020XK25)、国家重点研发计划（2016YFD0501209)、中国农业科学院科技创新工程（CAAS- ASTIP-2016-OCR1)资助项目
**通讯作者，：wanxia@oilcrops 谢工程、发酵工程等交叉学科为B C的环境友好型、高 效合成提供新思路
异戊二烯类化合物的合成前体物为异戊烯焦磷酸 醋（isopentenyl pyrophosphate，IPP)和其异构体二甲基 婦丙基焦鱗酸醋（isomer dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)m，二者的自然合成路径主要为甲羟戊酸途径 (mevalonate pathway,MVA)和甲基赤薛糖醇4-憐酸途 径（methylerythritol phosphate pathway,MEP)⑴。在异 戊二烯类化合物生物合成中面临的主要瓶颈之一是 IP P和DMAPP生成量不足。由于自然途径M VA和MEP当中的复杂调控与中心碳代谢流的竞争，可能导 致IP P和DMAPP生成数量较少[89]。为了突破这一瓶 颈，研究者构建了全新的异戊烯醇利用途径(isopentenol utilization pathway,IUP)，优化后的该途径
38中国生物工程杂志China Biotechnology Vol.41 No.4 2021
由酿酒酵母来源的胆碱激酶（choline kinase from •Sacc/iaromyces，ScCK)和拟南芥来源的异戊稀憐酸激酶（isopentenyl phosphate kinase from
—/iamz，AtIPK)两种酶组成，能分别将异戊烯醇催化为异戊婦磷酸（isopentenyl monophosphate, I P)和 IPP。IU P途径已在大肠杆菌中被鉴定，且被证实与MVA、MEP途径和中心碳代谢流互不干扰[1°_13]，故IU P可以 避开细胞严格的调控机制，高效合成IP P，为下游异戊 二烯类化合物的生物合成
提供充足的前体物质，但是 关于ScC K和A tIPK的生物学基本性质、结构与功能还 未得到进一步揭示。
长链异戊二烯类化合物在水相中的溶解度较差[14]，而常规的宿主细胞内环境多为亲水性细胞质，由于它们 与细胞质不相容，主要被脂膜隔离并积累在细胞膜上，进 而会限制异戊二烯类化合物的大量积累。有研究表明，如果宿主细胞内包含更大的疏水区域，则可以容纳更多 的异戊二烯类化合物[3’15]。解脂耶氏酵母（
^〇〖>Ca)是一种非常规的高产油酵母，被美国食品药品 监督管理局（Food and Drug Administration, FDA)认证为GRAS(Generally Recognized As Safe)菌株 16]。在解脂耶 氏酵母中引入IUP，可以直接将解脂耶氏酵母中内源的 异戊二烯醇转化为ip p[i°_13’17_18]，不仅规避了自然途径对 异戊二烯类化合物合成的天然限制，同时还可以利用解 脂耶氏酵母细胞的疏水性更多的积累异戊二烯类化合 物[3’111。利用该策略，已经成功在解脂耶氏酵母中实现 高效积累番茄红素[19]。
本研究应用多种生物信息学工具对ScC K和AtIPK 蛋白进行理化性质、亚细胞定位、跨膜区和信号肽、空间 结构及蛋白互作网络进行分析，进一步明确其结构与功 能，尝试对IU P高效合成IP P作出合理解释。此外，将 B C作为异戊二烯化合物模型，在产B C的解脂耶氏酵母 工程菌中引人IUP并探究不同碳氮比、异戊二烯醇添加 量和发酵时间对B C产量的影响，为开发新的合成生物 学途径促进异戊二稀化合物的生物合成提供理论参考。
1材料与方法
1.1材料
1.1. 1菌株和质粒本研究使用的质粒和菌株详见表1。
表1实验所用质粒和菌株
Table 1Plasmids and strains used in this study
Strains or plasmids Characteristics or genotype Sources pYLXP,Amp, Leu2marker, TEF promoter and XPR2 terminator Our lab pYLXP"2Amp, Ura3marker, TEF promoter and XPR2 terminator Our lab prDNALoxp Amp, Leu2 and Ura3 marker, 26S rDNA, loxp, TEF promoter and XPR2 terminator Our lab pYLXP^ :: idi pYLXP'2 derivative expressing idi from Y. lipolytica This study pY L X P^:: ScCK pYLXP;2 derivative expressing ScCK from S. cerevisiae This study pY LX?'2 ..AtIPK pYLXP^ derivative expressing IPK from A. thaliana This study pYLXP^ :: ScCK ..AtIPK pYLXP^2 derivative expressing ScCK and AtIPK This study pYLXP，2 :: S c C U/P A：:：沾pY LX P^ derivative expressing ScCK, AtIPK and idi This study prDNALoxp :: ScCK ：： AtIPK ：：idi prDNALoxp derivative expressing ScCK, AtIPK and idi This study
pYLXPf carRP ••thmgR ••••GGS1 :: carB pYLXP, derivative expressing thmgR, GGS1from Y. lipolytica and carRP, carB from
Mucor circinelloides
This study
prDNALoxp ：：carRP:: thmgR:
GGS\ ••carB
prDNALoxp derivative expressing ggs/ and carfi This study E. coli DH5a F-cp80 (lacZ)AM15 A(/acZYA -argY)U169 endAl recAl h sd R ll(r'K, ) supFAA
X-thi-\ gyrA96 relAl phoA
TsingKe Polf Y. lipolytica,MATa, leu2-270, ura3-302, xpr2-322, axp-2, (Leu2~, Ura3-)Our lab YLBC pol i-carRP-thmgR-GGS1 -carB This study YLBCp pol f ：： pYLXP; :: carRP :: thmgR :: GGS1 '■ carB This study YLBC-IUP poli-carRP-thmgR-GGSl-carB-ScCK- AtIPK -idi This study * thmgR,truncated hydroxymethylglutaryl-CoA reductase gene；g g s l,geranylgeranyl diphosphate synthase gene^20
2021,41(4)朱航志等：引人新型异戊二烯醇利用途径促进解脂耶氏酵母中p-胡萝卜素的合成39
1.1.2培养基和培养条件大肠杆菌用培养基及培 养条件：（1)Luria-Bertani(LB)培养基：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，PH7.0，固体培 养基需添加琼脂粉15 g/L，用于转化筛选时添加氨苄青 霉素至终浓度50 jjL g/mL;(2)培养条件：固体培养基为 37丈恒温培养箱倒置；液体培养基为37 t、220 r/min。
解脂耶氏酵母用培养基和培养条件：（1)培养基：酵母膏腺葡萄糖（yeast extract tryptone dextrose，YPD)培 养基，酵母完全补充混合（complete supplement mixture，CSM)培养基，筛选用培养基CSM_U R A、CSM^及 C S M iu'均参考文献[19’21];(2)培养条件：固体培养 基为28丈恒温培养箱倒置；液体培养基为28丈、220 r/min。
1.1.3主要试剂和仪器主要试剂：聚乙二醇PEG 6000，购自Sigma-Aldrich；无氨基酵母氮源（YN B)、鲑 鱼精 DNA(salmon sperm DMA，ssDNA)，均购自上海源 叶生物科技有限公司；酵母完全补充混合培养基CSM‘U R A、CSM_LEU和 CSM-1•訓RA，购自 MP Biomedkjals；甲醇（HPLC级），购自 ThermoFisher Scientific;BC 标准品、甲基叔丁基醚（HPLC级）和异戊二烯醇（isoprenol)，均 购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RNAiso plus (108/9109 )、PrimeScript™RT reagent kit with gDNA eraser(RR047A)，均购自 TaKaRa；内切酶、T4 DNA 连 接酶等工具酶均购自纽英伦生物技术（北京）有限 公司。
主要仪器：安捷伦1200型高效液相谱仪，YMC 谱柱 YMC Carotenoid C 30(4. 6 mm x250 mm,5 p m)，BioRad荧光定量 qrt-PCR仪（CFX Connect)。
1. 2 ScCK和A tIP K的生物信息学分析
ScCK (AAA34499. 1)和 AtIPK (AAN12957. 1 )氨 基酸序列下载自NCB丨（bi.v)数据 库〇利用 ProtParam (/protparam)分析 蛋白不稳定系数、相对分子量、理论等电点（p i)、脂肪 系数、总平均亲水性系数等理化性质；利用TM - HMM (www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)预测蛋白质的跨膜区；利用Signalp  5. 0 Server(www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP)分析信号肤；利用 PSORT version6.4 (psort.hgc.jp)分析亚细胞定位；利用NetNGlyc  1.0 (www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)^ NetPhos 3. 1 (www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和 Motif Scan (myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan)分析 N-糖基化、磷酸化和翻译后修饰位点；利用SOPMA(npsa-prabi.ibcp.fr)分析蛋白质二级结构；利用SWISS-MODEL ()进行蛋白质三级结构预测_]。
1.3解脂耶氏酵母工程菌株的构建
以pYLXP'、pYLXP^和prDNALoxp为出发材料构 建得到相关质粒（表1)的流程基本概述为：（1)连接转 化和转化子鉴定：将合成的基因片段使用无缝重组试剂盒按说明书进行首尾连接，然后转化进人大肠杆
菌DH5cx感受态细胞，用含氨苄青霉素的L B平板进行筛选，挑取转化子接液体含氨苄青霉素L B过夜培养并测 序；（2)多基因克隆载体的构建：将（1)所得到的载体用 内切酶进行酶切得到线性化载体和基因片段，使用T4 D N A连接酶进行连接后转人大肠杆菌DH5a感受态细 胞，挑取转化子过夜培养，用试剂盒提取质粒进行酶切 检测[1M°’24]。
参考Luo等™和L v等[21]方法将活化好的解脂耶 氏酵母菌液涂于固体培养基平板，在28 t条件下培养 48 h；用无菌 1. 5 mL 离心管，加人 PEG6000 90 j j l L、2 m〇l/L醋酸锂5 jxL和ssDNA 5 jxL混合均勻，在平板中 挑取一定量的待转化解脂耶氏酵母混合均匀，再加人 300 n g左右的质粒或26S rDNA IU P片段混匀，放于30 T温育40 min，并每隔10 m in震荡混匀一次，然后放于 39丈静置热激10 mm，最后加入300 p L无菌水涂于固 体平板培养基，倒置于28丈培养箱静置培养72 h至转 化子长出。初筛挑取转化后颜较深且较大的单菌落 (质粒表达按照1个基因挑至少6个，2个基因挑至少 12个,3个基因挑至少18个,26S rD N A基因组整合挑 至少20个），加人装有5 m L活化培养基的玻璃试管中，28 X；、220 r/min，培养 48 h 至 01^ > 0. 5，采用 1. 1.2的发酵培养方法扩大发酵72 h，根据1.6 B C提取 及分析检测方法测定B C含量，选取B C含量最高的转化子进行平行重复培养（n =3)。平行培养方法及BC 提取及分析检测方法同初筛。
1.4 ScCK和A tIP K基因表达分析
Trizol法提取Y1B C和Y1BC-IUP中的总RNA，使用 PrimeScript RT enzyme mix I 将待测RNA 逆转录成cDNA〇利用 SYBR green realtime PCR master mix 试剂 盒在BioRad CFX connect型荧光定量PC R仪上进行反 应。体系：2 xSybGreen raix，5 )xL;2. 5 |xmol/L Forward primer, 1(xL；2.5|xmol/L Reverse primer,1jjl L；c D N A,2 |xL;ddH20,l ja L。PCR 程序:95 T；3 min,95 t15 s, 60丈30 s,45个循环。以解脂耶氏酵母甘油醛-3-磷酸
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脱氛酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参，使用方法计算。
1.5异戊二烯醇浓度、培养基碳氮比和发酵时间对
B C产量的影响
参考Luo等[19]方法分别将培养基中异戊二烯醇初 始浓度设定为 〇mm〇l/L, 10 mmol/L,20 mmol/L,30 mmol/L，40 mmol/L，28 X；,220 r/min，使用 CS\TL K A(C/ N =80)培养基培养72 h；使用异戊二烯醇最优浓度并更换培养基为Y P D培养基，分别设置碳氮比例为2: 3，4:3,6: 3,8: 3,10: 3,28 t ,220 r/min 进行发酵培养72 h；在异戊二烯醇和葡萄糖最优浓度的基础上，分别 于24 h，48 h，72 h，96 h，120 h检测B C产量及生物量。以上均采用1.6方法提取B C进行后续检测。
1.6B C提取及分析检测
B C提取及分析检测参考文献[20]、[24]并略作修 改：取2 m L发酵液于A、B两个10 m L试管中，4 500 r/min离心10 min，去除上清，B试管置于70尤烘箱中 烘干称质量，A管加10 m L生理盐水重悬，以4 500 r/ m in离心10 min，将上清尽量取干净，加人含0.01 %truncated 翻译
B H T的乙酸乙酯6 mL，加人15 ~20颗3 mm玻璃珠，
4 200 r/min漩涡震荡 4
5 min，取 300 pL过 0. 22 pm疏 水性滤膜上机检测。高效液相谱条件：谱柱为YMC Carotenoid C 30(4.
6 mm x250 mm,5 |xm)，流动 相为A-B液梯度洗脱，0 ~90 min，0 %~ 100 %B液，100 % ~ 0 %A液。体积流量1.0 mL/min，柱温30 t，进样量10 p L，检测波长450 nm。流动相A液：甲醇：甲基叔丁基醚：水=81: 15: 4；流动相B液：甲醇：甲基叔丁基醚：水=7: 90: 3。
2结果与分析
2.1S c C K和A tIP K蛋白生物信息学分析
S cC K和A tlP K是IU P中的两个关键蛋白，已经在 大肠杆菌和解脂耶氏酵母中被证实可以高效催化异戊 二烯醇合成1PP[K^'19:，但是相关基本理化性质和空间 结构还未得到揭示，且二者高效合成IP P的机制尚不清 楚。在线分析结果显示，S c C K和AtIPK均由18种相同 的氨基酸构成，无跨膜区和信号肽，整体呈酸性带负电，二者蛋白中都含有较多的磷酸化修饰位点，具有较 高的生物活性，属于亲水性蛋白。由PS0R T预测，S cC K可能定位于细胞质,At[P K可能定位于线粒体基 质，通过S cC K和AtIPK蛋白的二级和三级结构（图1 )分析显示:S cC K和AtIPK蛋白中a螺旋比例都未超过一半，暗示ScCK和AUPK蛋白结构并不稳定:25]；无规 则卷曲在ScCK■蛋白中占比最大，在AtIPK中的占比仅 次于a螺旋，表明ScCK和AtIPK蛋白结构疏松，能够 便利的与其他分子相互作用。利用STEING数据库分 别对ScCK和AtIPK蛋白进行蛋白互作分析，构建主要 互作网络图（图1)，同时对二者的互作蛋白基因进行G O分析和KEGG通路分析。结果显示，ScCK互作基 因主要参与磷酸转移酶活性、胆碱激酶活性等分子功 能，显著富集于磷酸盐代谢等通路中，并涉及磷脂酰胆 碱生物合成、甘油磷脂代谢等生物过程；AtIPK互作基 因主要参与A T P结合、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶活动等 分子功能，显著富集于萜类化合物合成等通路中，并涉 及异戊烯二磷酸生物合成、类异戊二烯合成等生物过程。
异戊二烯醇到IP P的合成是不断进行磷酸酯化的 过程I，而ScCK和AtIPK均涉及磷酸类物质的合成，且二者疏松亲水性结构更利于与亲水性小分子异戊二 烯醇的结合，其组合将会进一步强化异戊二烯醇到1PP 磷酸酯化这一过程，推测这可能是1U P能够高效合成 IP P的原因。B C属于萜类化合物，预测分析
显示将IUP 在解脂耶氏酵母中表达，ScCK和AtIPK都可能会显著 富集于B C的合成通路，对B C的生物合成具有促进作用。
2.2在解脂耶氏酵母中从头合成B C及引入IU P对
B C产量的影响
异戊二烯醇利用途径缩短了 IP P的合成途径（图2a)，能够使解脂耶氏酵母IPP+ DMAPP的合成量提高 数倍，进而为异戊二烯类化合物的生物合成提供充足的前体物％]。本研究以B C的合成作为异戊二烯类化 合物模型，在解脂耶氏酵母P〇l f中引人合成B C合成 关键基因car/fP, c a r B，同时增加拷贝数
以强化M VA途径通过筛选，获得B C产量最高 为10. 53 mg/L(2. 5 mg/g)的质粒表达菌株YIBCp(图 2c)。在以番茄红素为模型的研究中发现，在解脂耶氏 酵母中S c C K和AtIPK均能够单独催化异戊二烯醇转 变为IPP%|9]，但IPP短时间的大量合成会对解脂耶氏 酵母细胞造成额外负担，而解脂耶氏酵母仅依靠自身W基因的表达不能有效催化〗P P到DMAPP的转化过 程，无法维持1P P与DM APP的动态平衡。为避免过量 1P P的积累对细胞产生毒害作用导致目的产物的积累 量下降，更好的平衡IP P和DM APP的比例关系，消除 因引人IUP对解脂耶氏酵母细胞的影响，需要同时过
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图1S c C K(a)和A tlPK(b)同源建模三级结构及蛋白互作网络
Fig. 1The tertiary of homologous modeling and protein interaction network of ScCK ( a)and AtIPK ( b)
表达 IDI (isopentenyl diphosphate isomerase)的编码基 因[1°]。为进一步确定S c C K和AtIPK对解脂耶氏酵母 B C的合成影响，使用菌株Y IB C p为原始菌株，以质粒 的形式表达下面5种组合：W，ScCX，/lt/PA：，SC C A:- 冶/W：，S c d/W P尺-述。结果显示，5种组合的工程菌 株中B C产量均有不同幅度增加，其中ScCX-zlt/P/f-述 的组合表达效果最好,B C产量为72.5 mg/L(7. 1mg/g) 达到原始菌株的6. 88倍，ScCK-AtIPK组合效果相对 较差，BC产量仅为22.6mg/L (3.5m g/g)，为原始菌 株的2.15倍（图3b)。结果说明ScC K和AtIPK在促进 IP P的合成增加B C的积累时，应该同时过表达W以平衡IP P和DMAPP含量，避免IP P的过量积累对细胞产生毒害作用[1°]。
基于质粒表达的基因具有遗传稳定性差和拷贝数 容易变异等诸多缺点[2M7]，因此将mr/^，
CCS7通过同源重组技术随机整合到P〇l f菌株 染体的26S rDNA位点，可能是受到插人位置和生物 量下降的影响，导致筛选获得BC最高产量仅为2.68 mg/L (1.05 mg/g)。利用 Cre-loxP 系统进行 ura 标签 回收获得Y1BC，而后再通过同样方法将&C/C- /WP/C-紐整合到Y1BC菌株染体的26S rDNA位点，并以含 有10 mmol/L异戊二烯醇为底物的CSM
培养基发酵

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