82020年 第12期一例PPRV阳性羊鼻拭子样本N、P、M、F、H基因的序列测定和遗传进化分析
赵文华1，李富祥1，尹 伟2，杨仕标1*
（1.云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明  650224；
2.嵩明县杨桥街道农业综合服务中心，云南 杨桥  651705）
摘 要：为对采集自昆明某大型牲畜交易市场的一例PPRV阳性鼻拭子样本进行追根溯源，设计引物采用RT-PCR方法进行PPRV病毒基因组关键基因N、P、M、F、H核苷酸序列扩增，并进行序列测定和遗传进化分析。结果显示：N、P、M、F、H基因均有预期片段扩增，其读码框（ORF）长度分别为1 578、1 531、1 008、1 641及1 830 nt；N、P、M、F及H构建的遗传进化树均显示所测毒株为基因IV型，同2013年在新疆伊犁山羊中检测到的毒株（KM091959）同源性最高，N、P、M、F、H核苷酸同源性分别为99.2%、99.0%、99.4%、99.6%和99.3%，推断氨基酸同源性分别为98.7%、98.4%、100.0%、99.8%和99.3%。研究表明，检测到的毒株仍为2013~2014年我国PPRV流行期的基因IV型毒株，变异较小；所测毒株的N、P、M、F、H 5个关键基因中，M基因最保守、其次是F/H基因，而N、P基因略有变异。
关键词：小反刍兽疫病毒；普通RT-PCR；N、P、M、F、H基因；序列测定；遗传进化分析；基因IV型
中图分类号：S 855.3 文献标识码：A 文章编号：1672-9692（2020）12-0008-06
Sequencing and phylogenetic analysis of N, P, M, F, H genes of PPRV
in a positive nasal swab sample detected in goat
Zhao Wenhua1, Li Fuxiang1, Yin Wei2, Yang Shibiao1*
(1. Yunnan Tropical and Subtropical Animal Viral Disease Laboratary, Yunnan Academy of Animal Husbandry and Veterinary
Medicine, Yunnan Kunming  650224; 2. Yangqiao Street Agricultural Integrated Service Center, Yunnan Yangqiao  651705)
Abstract: In order to trace the source of a PPRV positive nasal swab sample collected in a large livestock market in Kunming, N, P, M, F, H genes of PPRV virus genome were amplified through RT-PCR method with designed primers, and nucleotide sequence and phylogenetic analysis were carried out. The results showed that N, P, M, F, H had expected fragment amplification. The ORF length of N, P, M, F and H genes were 1 578, 1 531, 1 008, 1 641 and 1 830 nt, respectively. The phylogenetic trees constructed based on N, P, M, F and H all showed that the tested strain belonged to genotype IV, which had the highest homology with the strain (KM091959) detected in goat, Xinjiang Yili, 2013. Nucl
eotide homology of N, P, M, F, H was 99.2%, 99.0%, 99.4%, 99.6% and 99.3%, respectively, and deduced amino acid homology was 98.7%, 98.4%, 100.0%, 99.8% and 99.3% respectively. We concluded that the virus strain detected in the study was closest with those pandemic during 2013~2014 nation-wide outbreak and variation was minimal. Among the five key genes including N, P, M, F, H, M gene was the most conservative, followed by F and H genes, while N and P genes were slightly genetically variant. Key words: Peste des petits ruminants virus (PPRV); Routine RT-PCR; N, P, M, F, H genes; Sequencing; Phylogenetic analysis; Genotype IV
收稿日期：2020-07-15
作者简介：赵文华，博士，研究员，研究方向为动物分子病毒学。通讯作者：杨仕标，硕士，研究员，研究方向为临床兽医学。
基金项目：国家自然科学基金项目（32060809）；国家重点研发计划项目（2017YFD0501801、2017YFD 0501805）
小反刍兽疫（peste des petits ruminants，PPR）是由小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）引起，以发热、口炎、腹泻和肺炎为临床表现特征的一种急性或亚急性烈性传染病。在我国被列为一类动物疫病[1-2]。我国于2007年7月在西藏阿里地区首次发现
一例PPRV阳性羊鼻拭子样本N、P、M、F、H基因的序列测定和遗传进化分析
现代畜牧兽医9 2020年 第12期
PPR疫情[3]。2013年底PPR从新疆沿河西走廊向全国传播而大爆发。截至2017年，全国累计5万只羊发病，2.2万只羊死亡， 给全国养羊业造成巨大经济损失[4-6]。
PPRV基因组为单股负链无节段RNA，全长约16 kb，RNA链上从3'端至5'端依次排列着3'-N-P-M-F-H-L-5' 6个基因，分别编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白。根据N基因或者F基因遗传进化特性，可将PPRV划分为4个谱系I-IV，前3个谱系起源于非洲，IV型源于亚洲[7-9]。PPR主要在非洲和亚洲流行，流行基因型主要为IV型[10-12]。我国PPRV流行基因型主要为IV型[13-16]。2017年，安徽省獐鹿发生PPR疫情，该疫情为PPRVⅡ系毒株[6]。为对2019年底监测昆明辖区某大型牲畜交易市场时而检出的一例PPRV阳性鼻拭子进行追根溯源，以期为PPRV防控和净化提供参考依据，本试验采用RT-PCR法扩增PPRV病毒基因组N、P、M、F及H基因并进行遗传进化分析。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验样本
试验样本为采集自昆明辖区某大牲畜交易市场、经实验室实时荧光定量RT-PCR检测为PPRV核酸阳性的32号羊鼻拭子。
1.1.2 试剂及仪器
0.85%无菌生理盐水为实验室自己配制，用于采集鼻拭子样本及样本浸泡；TaKaRa MiniBest Viral RNA/ DNA Extraction kit用于病毒核酸（DNA/RNA）的抽提；TaKaRa MiniBest Plasmid Purification Kit（9760）用于质粒样品的抽提；TaKaRa Ex Taq（RR001A）用于普通PCR扩增；TaKaRa One Step RNA PCR Kit（RR024A）用于普通RT-PCR扩增；One Step PrimeScriptTM RT-PCR（Perfect Real Time，RR064A）用于实时荧光定量RT-PCR；TaKaRa MiniBest Agarose Gel DNA Extraction Kit（9762）用于DNA胶回收；pMDTM18-T Vector Cloning Kit（6011）用于T载体构建；DL2000 Marker、Goldview核酸染剂，均购自宝生物工程（大连）有限公司；GeneAmp PCR SYSTEM 9700普通PCR仪购自ABI公司；Nanovue Plus微量分光光度仪购自GE公司；Blowest Agarose购自上海生工公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇等其他试剂均为市售分析纯。
1.1.3 引物及探针
根据参考文献[17-18]及GenBank相关序列，设计PPRV基因组N、P、M、F、H全长ORF扩增引物，见表1。引物由大连宝生物公司合成，级别为HPLC级。将合成的引物、探针干粉用无RNAase酶的PCR级
水进行溶解，引物贮存浓度为100 μmol/L，引物工作浓度为20 μmol/L。
注：兼并碱基R（A，g）、Y（C，T）、M（A，C）、K（g，T）、S（g，C）、W（A，T）、H（A，T，C）、B（g，T，C）、V（g，A，C）、D（g，A，T）、N（A，T，g，C）。引物名称引物序列（5'→3'）片段大小/bp PPRV-N1F GGGRGAGGAGKAGGAGCAAGAY
1 618 PPRV-N1R GTGCGTCTGCTYAGCYGAGGAG
PPRV-P1F CACCGATGGGCAGARGAACAAG
1 536 PPRV-P1R GTTACGGBTGYTTRGCRAGAA
PPRV-M1F AGGAGCAAGGGYAACYGAGC
1 125 PPRV-M1R CTRTKTCGGGGARCCTTGGRGT
PPRV-F1F CCCYGCAYGCRCCGAAAGA
1 727 PPRV-F1R ATGCYRGATGATTCRGGYKATTCT
PPRV-H1F CCGCACAAARRGARAGRAT
1 82
2 PPRV-H1R RCTGGATTRCATGTTACCTCTA
表1 PPRV N、P、M、F、H基因扩增引物情况表
Tab.1 Primers for amplification of N,P,M,F,H genes of PPRV
1.2 试验方法
1.2.1 病毒基因组RNA提取
鼻拭子样本加入5 mL生理盐水浸泡过夜，取200 μL 用于病毒基因组RNA提取。将200μL已制备好的样本，加入1.5 mL离心管中，加入200 μL的Solution A，剧烈振荡混匀，室温放置5 min，加入75 μL的Solution B，混合均匀，12 000 r/min离心5 min。将上清液转移到2.0 mL收集管中，加入250 μL含1％冰乙酸的异丙醇，混匀，将上清液转移至另一新的2.0 mL收集管中的吸附柱中，12 000 r/min离心1 min，弃滤液。将500 μL的Rinse A 加入上述吸附柱中，室温静置1 min，12 000 r/min离心1 min，弃滤液。将800 μL的Rinse B加入上述吸附柱中，12 000 r/min离心1 min，弃滤液，再次12 000 r/min离心1 min。最后将吸附柱置于一新的1.5 mL的离心管上，在吸附柱膜的中央加入50 μL含2％RNase Inhibitor 的Elution Buffer，室温静置3~5 min，12 000 r/min离心洗脱DNA。弃去吸附柱，将收集有RNA液体的离心
管，贮存于-70 ℃冰箱备用。
1.2.2 反应体系及反应程序
阳性PPRV样品普通RT-PCR反应液配制，反应体系为50 μL：10×One Step RNA PCR buffer 5.0 μL、MgCl2 10.0 μL、dNTP Mixture 5.0 μL、RNase Inhibitor 1.0 μL、AMV Reverse Transcriptase XL 1.0 μL、AMV-Optimized Taq 1.0 μL、Primer PPRV-F 1.0 μL、Primer
10
Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine
2020年 第12期
PPRV-R 1.0 μL、Sample RNA（或阴性对照H 2O ）2.0 μL、H 2O 23.0 μL。各组分混匀后置ABI 9700普通PCR 仪进行反应，反应程序为：42 ℃、30 min，95℃、2 min，35×（94 ℃、30 s，50 ℃、30 s，72 ℃、2 min)，72 ℃、10 min。反应后跑2%琼脂糖凝胶于紫外灯下检测扩增结果。1.2.3 RT-PCR 扩增片段的纯化回收、克隆及序列测定
将扩增出的PPRV 阳性样本N、P、M、F、H 各基因片段回收，克隆连接至pMD-18T Vector，进行序列
测定和分析，具体详细试验操作步骤参考文献[19-20]。用DNAstar 软件对所测序列数据进行遗传进化分析和比对。2 结果与分析
2.1 PPRV 阳性32号鼻拭子样本N、P、M、F、H 基因的RT-PCR 扩增结果（见图1）
2 000 bp 1 000 b 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp
1
M
3
5
6
2
4
注：M 为DL2000分子标记；1为N 基因扩增；2为P 基因扩增；3为M
基因扩增；4为F 基因扩增；5为H 基因扩增；6为阴性对照。
图1 32号鼻拭子样本PPRV N、P、M、F、H 基因扩增电泳结果
Fig.1  The electrophoresis result of routine RT-PCR for NO.32 nasal swab sample amplified with PPRV-N, P, M, F, H primer sets
由图1可知，N 基因有1 618 bp 条带、P 基因有1 536 bp 条带、M 基因有1 125 bp 条带、F 基因有1 727 bp 条带、H 基因有1 822 bp 条带。
2.2 PPRV 阳性32号鼻拭子样本N 基因遗传进化分析（见图2，表2  ~表4）
图2 32号鼻拭子样品与PPRV 参考毒株N 基因ORF
核苷酸序列遗传进化树
Fig.2  Phylogenetic tree of no.32 nasal swab sample with PPRV reference
strains Based on the ORF nucleotide sequence of N gene
KT633939(IV)-N-ORF
MF443336(YN2014)-N KX354359(IV)-N-ORF KM816619-N-ORF KM091959-N-ORF
KY888168(Mongolia2016)-N KP868655(IV)-N-ORF 32N-ORF
FJ905304(Tibet2007)-N JX217850(Tibet2008)-N JF939201-N-ORF
KX033350(IV)-N-ORF KF727981(IV)-N-ORF MN657232(Turkey2018)-N KJ867542(IV)-N-ORF
KC594074(Morocco2008)-N KR828813(Nigeria2013)-N KM212177(Senegal2013)-N MF741712(II)-N KR781451(II)-N
KU236379(II)-N-ORF KR781449(II)-N-ORF KJ466104(II)-N EU267274-N X74443-N-ORF HQ197753-N
KR828814(Nigeria2012)-N EU267273(I)-N
KP789375(I)-N-ORF KJ867540(III)-N KJ867544(III)-N KJ867543(III)-N
5.7
4
2
Nucleotide Substitutions(×100)
由图2可知，基因ORF 长度为1 578 nt，通过与PPRV 各基因型参考毒株ORF 核苷酸序列比对，发现其属于基因谱系IV 型。由表3可知，与各基因型参考序列N 基因ORF 核苷酸同源性为88.5%~99.2%，同毒株KM091959、KM816619及MF43336核苷酸同源性最高，为99.2%，由
表4可知，与各基因型参考序列推导的N 基因ORF 氨基酸序列同源性为92%~98.7%，同毒株KM091959、KM816619、MF43336及KX354359氨基酸同源性最高，为98.7%。
GenBank
序列号来源
谱系KX354359中国浙江富源，山羊，2015年12月15日
IV MF443336中国云南，山羊，2014年IV KM091959中国新疆伊犁，山羊，2013年IV KM816619中国吉林，家养山羊，2014年4月9日IV KP868655中国广东东莞，山羊，2014年12月5日
IV KY888168蒙古国，山羊，2016年
IV KT633939中国新疆，野山羊，2015年1月20日IV JF939201中国西藏，山羊，2007年12月 IV JX217850中国西藏，野岩羊，2008年IV FJ905304中国西藏，山羊，2007年8月IV KX033350印度德里，山羊，2016年5月
IV KF727981印度，1996年IV KJ867542印度，1996年IV KC594074摩洛哥，高山山羊，2008年
IV MN657232土耳其安纳托利亚中部，绵羊，2018年9月
IV KR828813尼日利亚，山羊，2013年2月15日IV KM212177塞内加尔，山羊，2013年3月11日II MF741712塞拉利昂，山羊，2011年12月17日II KR781451科特迪瓦，山羊，2009年7月II KU236379利比里亚，山羊，2015年7月8日
II KJ466104加纳，绵羊，2010年II KR781449贝宁，绵羊，2011年10月 II EU267274尼日利亚，山羊，1976年 II X74443尼日利亚，1975年II HQ197753尼日利亚，山羊，1975年II KR828814尼日利亚，山羊，2012年5月9日
II EU267273科特迪瓦，山羊，1989年I KP789375塞内加尔，山羊，1969年9月3日
I KJ867540埃塞俄比亚，山羊，1994年 III KJ867543乌干达，山羊，2012年III KJ867544
阿曼，山羊，1983年
III
表2 PPRV 参考毒株情况表
Tab.2 The conditions of PPRV reference strains
2.3 PPRV 阳性32号鼻拭子样本P 基因遗传进化分析（见图3、表3、表4）
由图3可知，P 基因ORF 长度为1 531 nt，核通过与PPRV 各基因型参考毒株苷酸序列比对构建遗传进化树，发现其属于基因谱系IV 型。由表3可知，与PPRV 各基因型参考序列P 基因ORF 核苷酸序列同源性为87.6%~99%，同毒株KM091959、MF43336及KX354359核苷酸同源性最高为，99%。由表4可知，与PPRV 各基因型参考序列推导的P 基因氨基酸序列同源
现代畜牧兽医
11
2020年 第12期性为84.1%~98.4%，同毒株KM091959、KM816619、MF43336及KX354359氨基酸同源性最高，为98.4%。
图3 32号鼻拭子样品与PPRV 参考毒株P 基因ORF
核苷酸序列遗传进化树
Fig.3  Phylogenetic tree of no.32 nasal swab sample with PPRV reference
strains Based on the ORF nucleotide sequence of P gene
KT633939(IV)-P-ORF KY888168(Mongolia2016)-P MF443336(YN2014)-P KP868655(IV)-P-ORF KX354359(IV)-P-ORF KM091959-P-ORF 32P-ORF
KM816619-P-ORF FJ905304(Tibet2007)-P JF939201-P-ORF
JX217850(Tibet2008)-P KX033350(IV)-P-ORF KC594074(Morocco2008)-P KF727981(IV)-P-ORF MN657232(Turkey2018)-P KJ867542(IV)-P-ORF KR828813(Nigeria2013)-P KM212177(Senegal2013)-P MF741712(II)-P KR781451(II)-P
KU236379(II)-P-ORF KJ466104(II)-P
KR781449(II)-P-ORF KR828814(Nigeria2012)-P EU267274-P X74443-P-ORF HQ197753-P EU267273(I)-P
KP789375(I)-P-ORF KJ867540(III)-P KJ867543(III)-P KJ867544(III)-P
5.9
4
2
Nucleotide Substitutions(×100)
参考毒株与32号鼻拭子核苷酸同源性/%
基因N 基因P 基因M 基因F 基因H KX35435999.199.099.199.699.1MF44333699.299.099.499.699.3KM09195999.299.099.499.699.2K81661999.298.899.399.699.1KP6865599.098.899.399.699.2KY88816899.098.798.799.399.0KT63393998.998.998.398.198.9JF93920197.396.497.597.497.4JX21785097.396.397.497.397.2FJ90530497.396.497.597.397.4KX03335097.095.896.996.896.2KF72798195.495.195.397.396.6KJ86754296.997.397.697.896.7KC59407496.496.396.897.095.8MN65723295.795.895.596.595.3KR82881394.495.196.095.494.0KM21217792.590.392.391.890.5MF74171292.690.392.091.590.5KR78145192.190.392.491.890.2KU23637992.090.592.191.890.3KJ46610492.690.792.491.590.7KR78144992.590.392.592.090.7EU26727492.891.893.893.491.7X7444393.292.293.592.791.2HQ19775393.092.293.492.791.3KR82881493.190.994.392.990.4EU26727391.489.791.489.488.7KP78937592.391.492.491.089.6KJ86754090.487.689.489.288.6KJ86754388.589.090.987.887.2KJ867544
89.0
89.3
89.0
88.9
87.7
表3 32号鼻拭子样本N、P、M、F、H 基因与各参考毒株
对应基因ORF 核苷酸序列同源性
Tab.3 ORF Nucleotide Homology of N, P, M, F, H gene between
No.32 nasal swab and reference strains
参考毒株与32号鼻拭子氨基酸同源性/%
基因N 基因P 基因M 基因F 基因H KX35435998.798.499.499.699.3MF44333698.798.4100.099.699.3KM09195998.798.4100.099.699.3KM81661998.798.4100.099.699.2KP86865598.594.7100.099.899.2KY88816898.598.099.499.598.9KT63393998.398.299.198.599.0JF93920197.395.399.798.797.9JX21785097.395.199.798.797.9FJ90530497.595.399.798.797.9KX03335097.394.7100.098.597.0KF727981
94.792.597.398.096.9KJ86754297.096.398.898.797.0KC59407496.695.999.198.296.9MN65723296.895.198.897.898.0KR82881395.493.398.897.695.6KM21217794.389.098.596.792.8MF74171294.188.298.296.592.1KR78145194.188.298.296.792.3KU23637994.188.698.596.792.4KJ46610494.189.298.296.992.6KR78144994.389.098.594.792.4EU26727493.789.898.897.492.9X7444394.790.897.694.992.9HQ19775394.790.897.394.993.1KR82881494.588.698.595.292.4EU26727393.786.897.994.590.6KP78937594.788.498.296.391.6KJ86754093.584.196.794.791.5KJ86754392.485.597.094.190.1KJ867544
92.0
86.8
97.0
95.1
90.6
表4 32号鼻拭子样本N/P/M/F/H 基因与各参考毒株
对应基因推导氨基酸序列同源性
Tab.4 Deduced amino acid homology of N/P/M/F/H gene between
No.32 nasal swab and reference strains
正则化匹配26个字母python2.4 PPRV 阳性32号鼻拭子样本M 基因遗传进化分析（见图4、表3、表4）
由图4可知，M 基因ORF 长度为1 008 nt，通过与PPRV 各基因型参考毒株核苷酸序列比对构建遗传进化树，发现其属于基因谱系IV 型。由表3可知，与PPRV 各基因型参考序列M 基因ORF 核苷酸序列同源性为89%~99.4%，同毒株KM091959、MF43336核苷酸同源性最高，为99.4%。由表4可知，与PPRV 各基因型参考序列M 基因推导的氨基酸序列同源性为96.7%~100%，同毒株KM091959、KM816619、MF43336、KP868655及
12
Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine
2020年 第12期
KX033350氨基酸同源性最高，皆为100%。
图4 32号鼻拭子样品与PPRV 参考毒株M 基因ORF
核苷酸序列遗传进化树
Fig.4  Phylogenetic tree of no.32 nasal swab sample with PPRV reference strains
Based on the ORF nucleotide sequence of M gene
KM816619-M-ORF
KY888168(Mongolia2016)-M KX354359(IV)-M-ORF 32M-ORF
KP868655(IV)-M-ORF MF443336(YN2014)-M KM091959-M-ORF KT633939(IV)-M-ORF FJ905304(Tibet2007)-M JX217850(Tibet2008)-M JF939201-M-ORF
KX033350(IV)-M-ORF KJ867542(IV)-M-ORF
KC594074(Morocco2008)-M KF727981(IV)-M-ORF MN657232(Turkey2018)-M KR828813(Nigeria2013)-M KR828814(Nigeria2012)-M KM212177(Senegal2013)-M MF741712(II)-M KR781451(II)-M
KU236379(II)-M-ORF KJ466104(II)-M
KR781449(II)-M-ORF EU267274-M X74443-M-ORF HQ197753-M EU267273(I)-M
KP789375(I)-M-ORF KJ867540(III)-M KJ867544(III)-M KJ867543(III)-M
8.7
8
6
2
40
Nucleotide Substitutions(×100)
2.5 PPRV 阳性32号鼻拭子样本F 基因遗传进化分析（见图5、表3、表4）
图5 32号鼻拭子样品与PPRV 参考毒株F 基因ORF
核苷酸序列遗传进化树
Fig.5  Phylogenetic tree of no.32 nasal swab sample with PPRV reference strains
Based on the ORF nucleotide sequence of F gene
KX354359(IV)-F-ORF MF443336(CHYN2014)-F KM091959(CH2013)-F KM816619-F-ORF 32F-ORF
KP868655(IV)-F-ORF KY888168(Mongolia-IV)-F KT633939-F-ORF JF939201-F-ORF
JX217850(Tibet2008)-F FJ905304(Tibet2007)-F KX033350(IV)-F-ORF KF727981(IV)-F-ORF KJ867542(IV)-F-ORF
KC594074(Morocco2008)-F MN657232(Turkey2018-IV)-F KR828813(Nigeria2013)-F KM212177(Senegal2013)-F MF741712(II)-F KR781451(II)-F
KU236379(II)-F-ORF KJ466104(Ghna)-F KR781449(II)-F-ORF EU267274-F X74443-F-ORF HQ19775
3-F
KR828814(Nigeria2012)-F EU267273(I)-F
KP789375(I)-F-ORF KJ867540(III)-F
KJ867543(III)-F-ORF KJ867544(Oman-III)-F
5.2
4
2
Nucleotide Substitutions(×100)
由图5可知， F 基因ORF 长度为1 641 nt，通过与PPRV 各基因型参考毒株核苷酸序列比对构建遗传进化树，发现其亦属于基因谱系IV 型。由表3可知，与PPRV 各基因型参考序列F 基因ORF 核苷酸序列同源性为87.8%~99.6%，同毒株KM091959、MF43336、KM816619、KP868655及KX354359核苷酸同源性最高，为99.6%。由表4可知，与PPRV 各基因型参考序列推导的F 基因氨基酸序列同源性为94.1%~
99.8%，同毒株KP868655氨基酸同源性最高，为99.8%；同毒株KM091959、KM816619、MF43336、KX354359氨基酸同源性皆为99.6%。
2.6 PPRV 阳性32号鼻拭子样本H 基因遗传进化分析（见图6、表3、表4）
由图6可知，H 基因ORF 长度为1 830 nt，通过与PPRV 各基因型参考毒株核苷酸序列比对构建遗传进化树，发现其同样属于基因谱系IV 型。由表3可知，与
PPRV 各基因型参考序列H 基因ORF 核苷酸序列同源性为87.2%~99.3%，同毒株MF43336核苷酸同源性最高，为99.3%。由表4可知，与PPRV 各基因型参考序列推导的H 基因氨基酸序列同源性为90.1%~99.3%，同毒株KM091959、MF43336及KX354359氨基酸同源性最高，皆为99.3%。
图6 32号鼻拭子样品与PPRV 参考毒株H 基因ORF
核苷酸序列遗传进化树
Fig.6  Phylogenetic tree of no.32 nasal swab sample with PPRV reference strains
based on the ORF nucleotide sequence of H gene
6.3
KM091959-H-ORF KP868655(IV)-H-ORF MF443336(YN2014)-H
KY888168(Mongolia2016)-H KX354359(IV)-H-ORF KM816619-H-ORF 32H-ORF
KT633939-H-ORF FJ905304(Tibet2007)-H JF939201-H-ORF
JX217850(Tibet2008)-H KX033350(IV)-H-ORF KF727981(IV)-H-ORF KJ867542(IV)-H-ORF
KC594074(Morocco2008)-H MN657232(Turkey2018)-H KR828813(Nigeria2013)-H KR781451(II)-H
KU236379(II)-H-ORF KM212177(Senegal2013)-H MF741712(II)-H KJ466104(II)-H
KR781449(II)-H-ORF KR828814(Nigeria2012)-H X74443-H HQ197753-H EU267274-H EU267273(I)-H
KP789375(I)-H-ORF KJ867540(III)-H KJ867544(III)-H KJ867543(III)-H
6
4
2
Nucleotide Substitutions(×100)
3 讨论
FAO 和OIE 于2015年提出“2030年世界根除PPR”的倡议[20-23]。2015年，我国实施了国家根除PPR 计划。随着全国免疫计划的推进以及农业农村部和各地畜牧兽医部门的迅速处理，PPR 疫情已经得到基本控制，但仍在局部地区零星发生。
本研究表明，在昆明交易山羊中仍存在PPRV，为普遍流行的基因IV 型。此毒株最早可追溯至2013年的在新疆伊犁山羊中检测到的毒株（KM091959，China/XJYL/2013），F 基因核苷酸同源性高达99.6%、M 基因氨基酸同源性100%，即现在检测到的毒株仍同2013年末~2014年我国流行期的毒株相近。检出PPRV 阳性羊只为外地输入，应重视易感动物的疫苗免疫并加强动物流动管控，防止疾病从受感染的体传播到未受感染的体，从而避免该病的大规模流行。4 结论 
2019年11月份在昆明市某大型牲畜交易市场随机鼻拭子采样检测到PPRV 的存在，此毒株为PPRV 基因IV 型，最早可追溯至2013年的在新疆伊犁山羊中检测到的毒株（KM091959），变异不大；所测得N、P、M、F、H 5个关键基因中，M 基因最保守、其次是F、H 基因，而N、P 基因略有变异。研究中所测得序列已递交GenBank，获得序列号为MT109377-MT109379。

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。