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BIOTECHWORLD    生物技术世界精斑是、猥亵等案件中常见的生物检材，通过检出精斑DNA从而认定犯罪嫌疑人已经成为侦破该类案件的最直接、最高效的手段。但是遇到没有射精、输精管结扎术后人员、精子缺乏症患者等无精子、少精子的情况时，采用差异裂解提取法就很难检出嫌疑人STR。而采用Chelex法加入DTT和PK酶直接消化，消化液采用Identifiler Y-file试剂盒复核扩增分析可以获得嫌疑人Y-STR分型。
1 简要案情
案例一：某年10月30日，嫌疑人进入某校女生宿舍，在一寝室内以威胁并殴打的手段控制住3名女生，欲对她们轮流进行。在了第一名女生后，第二人时，由于受害人拼命反抗。嫌疑人放弃逃走。侦查人员提取了第一名女生姚某的阴道擦拭物数枚、内裤送检。
案例二：某年2月4日，年仅4岁的幼女李某在菜市场走失，家人寻回时发现李某衬裤和袜子不见了，到医院检查后发现有被人的迹象，遂报案，侦查人员提取了李某的阴道擦拭物数枚、内裤送检。
2 检验方法
2.1 初次检验过程
2.1.1 抗人前列腺特异抗原(PSA)金标试剂条检验
分别剪取两起案件的阴道擦拭物一枚与内裤裆部约2CM 2剪片放入1.5ml离心管中加入450ul纯水，室温浸泡30分钟，期间反复搅动。用抗人前列腺特异抗原(PSA)金标试剂条检验均呈阳性。
2.1.2 两步法提取精子DNA
其原理是利用女性上皮细胞和精子结构上的差异，在PK和SDS的作用下裂解上皮细胞，通过离心、漂洗弃上清液除去大部分女性DNA，再在PK、DTT和Chelex的作用下进行二次消化，释放出精子DNA。具体操作步骤：将检材离心弃上清后加400ulTNE溶液37℃浸泡30分钟。然后加入10% SDS至终浓度1%，加蛋白酶K至终浓度100μg/ml,37℃保温2小时以上。震荡消化液，吸取全部消化液转移至新1.5ml离心管中,12,000rpm离心3分钟。吸掉上清，沉淀物用TNE溶液重悬，离心漂洗一次。用纯水离心漂洗两次，得到沉淀物。向沉淀物中加入100μl 5% Chelex-100溶液、10μl 2mg/ml 蛋白酶K和5μl 1M DTT,56℃保温2小时以上。振荡5-10秒，干浴100℃ 8分钟，振荡5-10秒。12,000rpm离心2分钟,4℃保存备用。
2.1.3 STR 复核扩增与检测:
上述提取液分别用Identifiler-Plus试剂盒进行复合扩增，产物经AB3130XL遗传分析仪检测，采用GeneM
apperID V3.2软件进行分析。
2.2 重新检验过程
2.2.1 抗人前列腺特异抗原(PSA)金标试剂条检验
分别剪取两起案件余下的阴道擦拭物与内裤裆部剪片约
2CM 2，用抗人前列腺特异抗原(PSA)金标试剂条检验均呈阳性。
2.2.2 镜检
取检材少许分别置于载玻片上，加一滴精子染液(酸性复红美蓝染液,1%亚甲基蓝1ml、1%酸性品红1ml和1%盐酸40ml混合即成)，盖上盖玻片，显微镜下观察。结果均未检见人精细胞。
2.2.3 一步法提取混合斑DNA:
将检材离心弃上清，加入180μl 5% Chelex-100溶液、10μl 2mg/ml蛋白酶K和5μl 1M DTT,56℃保温2小时以上。振荡5-10秒，干浴100℃ 8分钟，振荡5-10秒。12,000rpm离心2分钟,4℃保存备用。
正则化匹配26个字母python2.2.4 STR 复核扩增与检测:
上述提取液分别用Y -f i l e r 试剂盒进行复合扩增，产物经AB3130XL遗传分析仪检测，采用GeneMapperID V3.2软件进行分析。
3 结果与讨论
对两起案件四个检材首先经行常规两步法提取，结果未获得常染体STR分型。再对余下的检材重新采用一步法直接提取，直接提取势必不能去除大部分女性DNA，所以我们采用针对Y染体特异性结合的Y-filer试剂盒进行复合扩增，结果两起案件均获得了单一的Y-STR分型，为案件提供了线索与证据。
精液主要由精子及精浆组成，精浆含有睾丸、附睾、精囊、前列腺等的分泌液，除大量精子外，精液的有形成分中还包括少量的睾丸细胞、白细胞、各种上皮细胞等等。传统两部提取法会将少量的男性非精子DNA在第一步消化后丢弃，反而会遗漏一些重要线索。采用一步消化法，混合斑在男性DNA模板浓度过低的情况下，由于优势扩增很难得到男性常染体STR分型。但是使用Y-STR试剂盒仍然能够得到扩增结果。所以传统两步法不能检出的精斑可以采用一步消化，并Y-STR扩增法。此外在性侵害案件中广大DNA检验技术员和现场勘验人员要拓宽思路，根据案情、受害人的陈述、现场分析等，对现场可能提取到的纯精斑检材，不妨先涂片、未发现精子后采用一步消化法、再采用STR扩增，这样可以大大增加无精子、少精子人员的常染体STR检出率。
此外通过这两起案件的检验可以看出传统显微镜下精子镜检的重要性，镜检精细胞的有无、量的多少，
对之后的检验方法选择、试剂用量多少有着重要的指导意义。Parastate Specialised Antigen，为男性前列腺液中一种特异性抗原，有的检验人员看到PSA试纸条阳性后往往不镜检就进行下一步差异裂解法消化。PSA试剂条阳性，只能证明该斑迹为前列腺液，而差异裂解法主要是检测精子的DNA。在性侵害案件中广大DNA检验技术员和现场勘验人员要拓宽思路，根据案情、受害人的陈述、现场分析等，对现场可能提取到的纯精斑检材，先涂片镜检、未发现精子后采用一步消化法、再扩增，这样可以大大增加无精子、少精子人员的常染体STR检出率。
Y-STR 技术在疑难精斑检验中的运用初探
周春雷  周恒  晏婷婷
(滁州市公安局  安徽滁州  239000)
摘要：精斑是、猥亵等案件中常见的生物检材，通过检出精斑DNA从而认定犯罪嫌疑人已经成为侦破该类案件的最直接、最高效的手段。本文通过两起案件中的精斑检材采用常规检验方法与一部消化提取法并Y-STR检验技术进行结果比较，对如何提高案中疑难检材的检出率进行探讨。
关键词:Y-STR  案件  无精细胞中图分类号:D919.2文献标识码:A 文章编号:1674-2060(2015)03-0185-01

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