MDS-结构域转录因子复合物在拟南芥花的发育中的作用
花器官的发育受到MDS-结构域多个转录因子的共同调控，然而这种机制是MDS-结构域蛋白激活或抑制目标基因的表达还是激活或抑制辅因子发生作用，大部分是未知的。
我们运用亲和提纯以及质谱测定法研究五种主要的同源MDS-domain结构域蛋白：AP1, AP3, PI, AG,and SEP3在花组织发育过程中相互作用机制——四聚体模型。在生物体外的研究表明MDS-结构域蛋白是灵活可变的，它依赖于相关蛋白质的浓度和DNA序列。通过原位双分子荧光互补实验证明MDS-结构域蛋白在花的分生组织阶段发生相互作用。通过有针对性的蛋白质组学的方法证实了MDS-结构域蛋白的相互作用，也就证明了MDS-结构域蛋白和染体重建因子之间的关系。进一步说，MDS-结构域的其它转录因子家族被鉴定出来，它们以特定的相互作用模式控制花的发育过程。
蛋白质复合物分离
正则化工具包转录调控
染质激活
组蛋白标记
花的发育在植物器官的发育过中理解最为清晰的。根据花发育的ABC模型根据对拟南芥花同源异型突变体同源异型突变体及其相关基因的研究表明花器官的形成受多个基因的控制，而且它们之间又是彼此关联的。在此基础上，Coen和Meyerowitz(1991)提出了花发育的ABC模型。该模型认为控制花器官发育的基因按功能可以分为三大类：即A功能基因、B功能基因和C功能基因。A功能基因单独作用控制萼片的发育；A和B功能基因联合作用决定花瓣的形成；B和C功能基因联合作用控制雄蕊的发育；C功能基因独立作用调节心皮的形成，并且A功能基因与C功能基因相互拮抗。因此，如果A功能基因丧失会使第一轮的萼片变成心皮，第二轮的花瓣变成雄蕊；B功能基因丧失会使第二轮的花瓣变成萼片，第三轮的雄蕊变成心皮；C功能基因丧失会使第三轮的雄蕊变成花瓣，第四轮的心皮变成萼片。在拟南芥中A功能基因是APETALAJ(APl)和APETALA2(AP2)。B功能基因是APETALA3(AP3)和PISTILLATA(PI) ，C功能基因是AGAMOUS(AG).
ABC模型自提出后得到不断的发展，后来提出了ABCE模型。E基因对花以及分生组织的形成不可或缺。通过基因实验和酵母双杂交实验人们提出了关于这些基因间相互作用的分子机
制的模型。著名的“四聚体模型”认为花四轮器官的发育是由A、B、C和E类基因的蛋白质产物所形成的四聚体决定的(Theissenand Saedler,2001)。在拟南芥中，APl．APl．SEP—SEP四聚体使第一轮花器官发育成萼片，APl一AP3．PI．SEP使第二轮花器官发育成花瓣，AP3．PI．AG．SEP使第三轮花器官形成雄蕊，AG—AG．SEP．SEP使第四轮花器官形成心皮。此外，含有A类基因产物的四聚体会抑制含有C类基因产物的四聚体的形成，反之亦然。这就是A类和C类基因间的相互拮抗。根据“四聚体”模型，这些蛋白首先形成二聚体，这些二聚体能与靶基因调控区的CArG元件(5’一CC[AT]GG一3’)特异性结合。然后两个二聚体通过蛋白的C末端形成四聚体。最终四聚体激活或抑制靶基因的表达，从而在特定的位置形成特定的花器官。该模型不仅是对经典的ABC模型的进一步完善，而且从蛋白质相互作用的角度对花发育的分子机制进行了深入的解释。E基因蛋白在四聚体的形成过程中起到了主要的调控作用。尽管这些基因的的相互作用在四聚体模型中已得到证明，我们通过体外DNA结合分析实验和原生质体fretflim实验进一步证明了这种相互作用。但是在内源性内生组织这些复合物的形成组成仍然是未知的。
通过酵母双杂交和转基因实验证明了其他MADS-结构域的其他转录因子例如SEU 和LUG的不同的相互作用。特定胚珠中的MDS-结构域的蛋白质复合物和BELL1形成更高阶的相互作
用。在酵母筛选显示 BELL1基因是转录因子同源框家族中的一员。当然，其它植物的MDS-结构域的蛋白质之间的相互作用已经报道，这些蛋白质在功能上类似于(PcG)蛋白质，在组成上类似于乙酰基转移酶复合物。证明了这种相互作用在转录调节的过程中起着重要的作用。因此，阐明植物同源MDS-结构域蛋白质相互作用能够加速我们对这些蛋白质相关的目标基因的转录机制和特异性的了解。
我们采用了免疫沉淀法、质谱分析和标签无量化来研究MDS-结构域蛋白质，结果显示不仅MDS-结构域蛋白质之间相互作用，MDS-结构域蛋白质和非MDS-结构域蛋白质之间也相互作用。在这些影响因子中，那些与染质重塑和修饰相关的因子起着突出的作用。
结果
花的同源框MDS-结构域蛋白质在花组织中相互作用。为了分析花的同源框MDS-结构域蛋白质在花组织中的相互作用，我们利用转基因植物，转入AP1, AG, AP3, and SEP3使之表达，并用GFP连接这些基因的原始启动子作为C 末端合，从而标记出表达产物。通过免疫沉淀法（反-GFP抗体）将蛋白质分离，利用质谱分析和无标签化蛋白质定量分析法定量定性分析蛋白质。通过免疫沉淀法，我们所研究的蛋白质与标本蛋白质进行比照，从而得出他们含量的
近似值。我们的结果证明了所有主要的蛋白质都在花的四聚体模型。我们发现B基因获得同源蛋白质基因AP3 and PI 作为对方的主要相互作用的伙伴，免疫沉淀法的标本显示它们的含量基本相同。同时，被假定的高阶的复合物伙伴，例如SEP3、AP1、AG被认为是AP3 and PI. SEP3的作用伙伴，AP3 and PI. SEP3在高阶复合物的形成过程中作为中介物，似乎是和B基因蛋白质相互作用的因子中含量最为丰富。 SEP3被认为是AP1 and AG的相互作用的伙伴，他的间接同源基因SEP4被发现是AP1 和AG的相互作用伙伴，从而证明了它在MDS-结构域蛋白质复合物的主导作用。这些结构域蛋白质在花蕾形成萼片发育的过程中起作用。利用SEP3-GFP 作为诱导，与果实有关的基因SHP1,2和与特定胚珠有关的基因STK 也属于ABC模式花的同源蛋白质基因。这也就说明在胚珠中高阶MDS-结构域蛋白质的作用要归功于D基因。当用SEP诱导时，与雄蕊和心皮有关的复合物，例如AG 和 B基因蛋白质要比API蛋白质表达更强烈。这能够反应出在花序组织取样是一定复合物含量，然而组织最大相关含量与稍后的花器官分化相一致。在AG-GFP 免疫沉淀法中， AP3和AG蛋白质表达含量几乎差不多，尽管我们预期的是几乎没有AP3与AG相互作用因为心皮的形成。这也就反应出复合物稳定性，组织样本，从引诱蛋白质上淋洗的效率，蛋白质水平的估计的不同
用AP1-GFP 作为诱导因子，我们能够发现超表达和能量的相互作用，SOC1的超表达的抑制
作用，SOC1是花的转录过程中主要的调控因子。另外，SOC1是FUL的主要合作者，从而证明了FUL/SOC1蛋白质复合物在花的发育过程中发挥着作用。用FUL-GFP 作为诱导因子，我们发现一些花的同源蛋白质，特别是AP1 和SEP 蛋白质，和FUL蛋白质相互作用。和内生组织的FUL相反，在蓓蕾阶段1和阶段2我们已经发现FUL- GFP 转基因的表达，稍后在出现在轮生体的2轮和3轮。这也许说明了已经观测到的FUL和MDS-结构域蛋白质的相互作用。显然，用AP1和FUL作为诱导因子，那些表达的蛋白质并不出现在异测的的复合物中，因为那些参与相互作用的蛋白质含量远远低于有到蛋白质的含量。这也就反映出这些蛋白质以二聚体或单体的形式出现或者在生化分离的过程这些蛋白质的神经细胞突的复合物的以低稳定性存在。尽管 连接GFP的AP1和 FUL 能够促使突变体显型，这样就使基因改造的AP1- GFP and FUL-GFP的蛋白质和那些内生的蛋白质相比含量提高或者更加稳定 。在基因改造的过程中那些和它们相互作用因子有关的蛋白质过表达。
为了得到植物的MDS-结构域蛋白质在相互作用过程中更为详细的空间信息，我们运用双分子荧光互补试验。利用内源性的启动子表达的MDS-结构域蛋白质使与N-末端或半个eYFP的C-末端 融合。运用这种方法，我们能够鉴定出SEP3 和AG,SEP3 和 AP1, AP3 和PI在花的分裂组织的相互作用。花器官开始形成，花的分裂组织发育的时期这种相互作用会被观测到
然而AG/SEP3和AP1/SEP3 h异二聚体主要在细胞核，AP3/PI 二聚体则均匀分布在整个细胞
关于DNA的MDS-结构域的蛋白质四聚体模型的形成。
对于异测高阶的MDS-结构域蛋白质复合物如何装配以及如何连接它们的目标DNA的过程我们还不清楚。直到今天, 在体外在出的只有DNA结合的同型四聚体和类似四聚体模式的，如由SEP3组成的同型二聚体和由AP3/PI组成的异型二聚体。我们发现在SEP3启动子的调节区域一定是MDS-结构域的一些蛋白质基因，例如AP1, SEP3, FUL, 和AG ，选择这些区域来研究DNA结合的高阶的MDS-结构域蛋白质复合物 。−2.6 and −3.1 kb千字节的末梢的SEP3启动子区域，包含着MDS转录因子的结合为点，对花组织的表达以及诱导过程SEP3的积极自动调整是必须的，在花的分生组织阶段AP1也是必不可少的。在体外，两对 CArG 盒子距离ChIP 的聚集区域最近，并且盒子3强烈的与MDS-结构域蛋白质结合。我们选择片段3，包含着CArG 3 和 CArG 3′的盒子来进一步分析。在这段序列中AG, SEP3,和AP1蛋白质以同源二聚体的形式结合 ，AP3/PI 以异源二聚体的形式结合。当 SEP3和AG或AP1共同出现时，我们可看见异测DNA结合的高阶蛋白质复合物的形成。当用丢失C末端的SEP3蛋白质时，之中形成过程被废除，处于K-结构域的α螺旋参与到高阶复合物的形成过程。高阶蛋白质复合物
祥光的弱带在SEP3, SEP3ΔC, 或AG蛋白质之一会出现，产生于MDS二聚物，这些二聚物和探针上DNA结合的位点相分离。下面，我们分析由SEP3, AP3, 和PI 组成的DNA结合的高阶的复合物，这些复合物业包含着和花瓣有关的AP1或和雄蕊有关的AG 。我们发现在四聚体复合物的转移过程显示两条带，预示着至少由两个不同的高阶复合物由这段DNA序列转录而来，这段DNA序列属于四种不同的MDS-结构域蛋白质。通过蛋白质滴定实验来分析这个复合物的组成。结果显示SEP3对于四种复合物的形成都是必须的。AG只出现在高阶复合物，较低的带可能有这两种不同的复合物。一种包含AG基因，另一种不包含AG基因。 AP3 和PI 蛋白质出现在低阶复合物因为它们的含量就会影响这些蛋白质。当所有的蛋白质以相同的含量出现时，较强的DNA条带SEP3/AG/SEP3/AG ，较弱的DNA条带SEP3/AG/AP3/PI 和SEP3/SEP3/AP3/PI 将会形成。进一步，在SEP3启动子原件时，我们也观测到由SEP3 和 AP1组成的，或SEP3, AP1, AP3, and PI 组成的蛋白质复合物的形成。这种结果显示了不同组成的MDS结构域蛋白质复合物能在一个细胞里共存。这种复合物可能和相互作用因子或DNA结合位点竞争。
为了了解两个CArG 盒子在高阶复合物的形成过程的作用，我们在序列缩短的地方产生一个探针。我们发现只有一个CArG 盒子在异测的高阶的MDS结构域蛋白质复合物的行程中是足
够的。有一小段DNA序列是必须的（在这个实验中，大约在-85kb）。这样的结果预示着额外的非序列特异性DNA位点使结合的高阶复合物更稳定，这些复合物的相关的DNA只出现在一个CArG 盒子里,这就证明和拓展了先前预测的研究结果。
MADS-结构域蛋白质和核小体改造体以及其他的转录调控因子相互作用。核蛋白提取的凝胶过滤实验证明SEP3是蛋白质复合物的主要部分，大约是670 kDa ，远远超过了MDS异四聚体。因此，我们运用质谱分析以及标签无量化分析那些本来没有MDS蛋白质，在免疫沉淀反应中却大量表达的复合物。在所有的MDS结构域蛋白质的IP数据集上中，那些在不断增加的蛋白质，我们发现一些核小体重塑的相关因子，例如REF6，最近在组蛋白 H3K27甲基化酶被研究分析。这也就证明了MDS结构域蛋白质能够改变或征集最基本的碱性染质的改造机制来目标基因的启动子的结构。 通过交互复杂的分离和免疫沉淀法证实了选择的相互作用。得出的结论是MDS结构与蛋白质转录因子征集核小体改造机制使目标基因的启动子更加的灵活，但是在一些实例中和骚有稳定的相互作用证明那个研究结果—PI和CHR4或CHR11/17由于DNA的出现而稳定
我们也分辨了先前具有特征的MDS结构域相互作用的伴侣，例如转录调控因子SEU和它的伴
侣LUH 。针对最基本的转录因子，我们发现其他家族的转录因子作为MDS结构域的相互作用的伴侣。ARF2和SPL8在（AP1和AG）的IP样本中大量表达。分析API的ChIP-SEQ 的数据，能认出ARF结合大量存在，在模体SEP3 的ChIP-SEQ也大量存在。另外，我们发现SPL8的DNA结合模体在 SEP3 ChIP-SEQ的数据大量存在，这也就证明了在相同的基因区域它们装配成复合物结合到临近位点。

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