2021-07-04CRISPR-Cas9基因编辑原理详解
CRISPR-Cas 系统（The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats-associated protein systems）是⼀个细菌及古细菌进化出来⽤以抵御病毒和质粒⼊侵的适应性机制。CRISPR-Cas 系统的⾼效基因组编辑功能已被应⽤于多种⽣物，包括斑马鱼、⼩⿏、⼤⿏、秀丽隐杆线⾍、植物及细菌。多个科研⼩组的研究都显⽰，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相⽐较，CRISPR-Cas 系统介导的基因组靶向实验在细胞或斑马鱼中具有相似甚⾄更⾼的效率。
CRISPR-Cas9 体系的 RNA-DNA 识别机制为基因组⼯程研究提供了⼀项简便⽽强⼤的⼯具。该体系其中⼀个最重要的优势是 Cas9 蛋⽩可在多个不同的 gRNA 的引导下同时靶向多个基因组位点。
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图 1. CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑原理图
在 II 型 CRISPR 系统中，CRISPR RNA（crRNA）与转录激活 crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退⽕形成的复合物能特异识别基因组序列，引导 Cas9 核酸内切酶在⽬的⽚段⽣成 DNA 双链断裂（double-strand breaks, DSBs）。 这个识别复合体可以通过融合crRNA 与 tracrRNA 序列形成 sgRNA（single-guided RNA）进⾏简化。基因组的靶序列中有长约 20bp 的⽚段与 crRNA 或 sgRNA 互补配对；靶序列末端的三核苷酸区域 PAM（5『-NGG-3』）为 Cas9 识别位点，是实现剪切功能的关键。
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图 2. CRISPR-Cas9 介导的基因编辑。（左）：sgRNA 引导 Cas9 核酸酶作⽤于基因组，形成的 DSBs 被⾮同源末端连接（NHEJ）机制修复；（右）：sgRNA 引导 Cas9 核酸酶作⽤于基因组，形成 DSBs，同源重组（HR）作⽤下，供体质粒上的⽬标基因及筛选标记（或其他遗传元件）在断裂处被整合进基因组。
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图 3: 切⼝酶在结合链⽣产单链切⼝的原理图
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