BD CBA：常见问题解答
BD CBA产品有哪些？
BD CBA产品包括：
-kits（试剂盒）
-Flex set（自由组合试剂）
-Enhanced Sensitivity Flex Sets（高灵敏度自由组合试剂）
-Functional Beads（功能性微球）
1）BD CBA KITS包含实验所需的所有试剂，以下试剂盒为常见的CBA kits（除非特别注明，通常每个试剂盒可做80个样本）
2）BD CBA Flex Sets 每个独立包装可检测某一特定的蛋白，不同检测因子的独立包装可搭配在一起组合为多参数的实验（多达30多种因子）。可选择的Flex Sets产品参见如下网址：
www.bdbiosciences/reagents/cytometricbeadarray/products/flexsets.jsp
每个独立的Flex set 包含捕获微球、PE标记的检测抗体以及重组的标准品。以下的buffers（称为master buffer kits）推荐用于CBA Flex Sets试验。在Master buffer kits里包含流式细胞仪的仪器调校微球。
3）BD CBA Enhanced Sensitivity Flex Sets 普通的Flex Sets规格相同，只是与之相比灵敏度更高。每一个Enhanced Sensitivity Flex Set包含捕获微球、检测抗体Part A以及重组的标准品。检测抗体Part B在相应的Master buffer kit里提供。
4）BD CBA Functional Beads 用于包被特异性抗体、蛋白或者多肽，以用于Flex Sets的捕获微球。包被功能性微球时推荐独立的专用buffer （Functional Bead Conjugation Buffer Set, Cat. No. 558556, 15 reactions)。
对于BD CBA功能性微球，有30种特异的微球位置可供选择。完整信息请参见
www.bdbiosciences/reagents/cytometricbeadarray/products/flexsets.jsp
注意：BD CBA Flex Sets, Enhanced Sensitivity Flex Sets, and Functional Beads 都是作为完整的试剂独立使用。试验中不能将不同试剂盒中的成分混合使用。
补充试剂：flex软件
BD CBA Assay Diluent (Cat. No. 560104) 用于Human and Mouse/Rat Soluble Protein Master Buffer Kits.不推荐用于Cell Signaling Master Buffer Kit or BD CBA kits.
Wash Buffer (Cat. No. 560105) 可用于所有的BD CBA KITS 和BD CBA Flex Sets。
A 30-plex bead mixture (Cat. No. 558522, 10 tests)可用于验证BD CBA Flex Sets 或 Functional Beads的校正。
重组的蛋白标准品可用于大多数BD CBA kits, Flex Sets及 Enhanced Sensitivity Flex Sets。也可提供独立包装。
高灵敏度的检测抗体PartB  (Cat. No. 561519) 在Enhanced Sensitivity Master Buffer Kit中独立提供。
BD CBA 实验可用于哪些BD 流式细胞仪平台？
BD CBA试验时如何进行仪器调试？
仪器调试说明书及模板可在如下网址下载www.bdbiosciences/cbasetup或者联系相关技术人员索取。
为防止数据丢失，在BD FACSCalibur仪器上操作BD CBA试验时，请不要将单激光的调试模板用于双激光的仪器。
BD CBA数据如何分析？
所有的BD CBA数据都可以用软件FCAP Array™ （货号： 645447 适用于windows系统，货号：641488 适用于Mac系统）进行分析。
BD CBA微球的物理特性？
BD CBA微球的原料为聚酯乙烯，平均大小在7.5u M。BD CBA kit中捕获微球含有一种荧光染料，而在Flex Sets、Enhanced Sensitivity Flex Sets以及Functional Beads中捕获微球带有两种不同的荧光，便于同时检测30多种特异性蛋白。BD CBA微球可被488 nm 或532 nm，及 633 nm或635 nm的激光器所激发，发射光谱在576 nm, 660 nm, and >680 nm接收。
BD Mouse Ig 同型对照 CBA KIT 可进行定量吗？
不可以。此试剂盒只可用于定性分析。
对于血清和血浆样本，应使用哪种抗凝剂？
我们还没有广泛验证肝素抗凝的血浆用于BD CBA的检测结果，但是一般来说与EDTA抗凝的血浆差异不会太大。由于蛋白水平及组分的不同，血清及血浆样本中蛋白的重复性及线性程度差异较大。但这并不影响样本产生固有蛋白质的能力及不同样本间结果的可比性。
总的来说，在稀释样本与捕获微球共同孵育之前，血清样本应该离心去除所有的沉淀物。
溶血是否会影响BD CBA的结果？
少量的溶血不会对BD CBA结果有影响，因为样本上机之前会进行洗脱的步骤。
BD CBA样本在分析之前是否可以固定？
BD CBA的样本在实验之前不能固定。BD CBA实验结束之后，样本可以用1%多聚甲醛固定、洗脱，随后上流式细胞仪进行检测。这可能会影响总体的检测信号及不同蛋白的灵敏度，但是不会完全干扰检
测信号。
BD CBA标准品稀释之后的稳定性如何？
建议配成溶液的BD CBA标准品在12小时之内用完，且不能反复冻融。用于信号通路的CBA 标准品
在溶解之后可在4 °C储存3个月。
BD CBA中的重组蛋白质标准品的来源是什么？
重组蛋白质表达于昆虫细胞或大肠杆菌。
人CBA KITS中的血清增强buffer或用于Flex Sets的human soluble protein Master Buffer Kit中血清/
血浆样本捕获抗体稀释液有什么作用？
这些buffer中含有可阻滞人的血清中人抗鼠抗体的成分。这些抗体有时会与试验中捕获抗体或检测抗
体结合导致假阳性。
人趋化因子检测试剂盒（Cat. No. 552990）不包含血清增强剂。因为它会使某些特异性蛋白的检测信
号减弱50%。具体原因尚不明确，但是血清增强剂对趋化因子的影响比其他细胞因子强。
由于BD CBA Flex Sets 的操作流程与BD CBA kit不同，所以血清/血浆捕获抗体稀释液并不影响Flex
Sets中趋化因子的检测。
实验过程中，除了CBA的分析试剂盒，我们还需要准备什么？
除了试剂盒中所包含的成份外，若要进行CBA分析实验，还需要流式液相多重蛋白定量技术分析软件FCAP Array，此软件主要是用于分析您的实验数据。虽然实验数据的分析可以不使用CBA的特定软件，但是，由于CBA实验中所采集的数据较为繁杂，若不通过专用的CBA软件进行分析，则进行数据
分
析的时间将显着增加。此外，用户还需要至少有一个488nm激光器及3个荧光参数接收的流式细胞仪。
样本制备管的选择需注意什么？
推荐用聚丙烯管制备样本，不要用玻璃管或器皿。玻璃容器可导致检测信号减低，得出错误的结果。
CBA分析中在进行标准曲线的配制时，有什么需要特别注意的地方？
CBA试剂盒中所提供的标准样品是蛋白冻干粉，由于大部份的标准样品属细胞因子类的敏感型蛋白，
在重悬标准样品成溶液或进行标准样品稀释时，不可采用振动混匀及剧烈吹打的方式处理标准样品，
在加入溶液后，只需放于室温下平衡15 分钟即可。在进行标准样品的系列稀释时，只需轻轻吹打样
品数次即可。否则，由于制成溶液后的标准样品不稳定，经剧烈混匀后易降解失活，影响实验中标准
曲线的拟制。
是不是每次实验都要使用一瓶新的标准品？
标准品在配成溶液后不稳定，12小时后将不能再使用。在每次实验前都要重新配置新的标准品溶液。
为什么振动混合捕获微球这个实验步骤如此关键？
CBA 试验中捕获微球混合时必须充分地振动混合5-10秒钟，以防止微球聚集成团。若混合不足会导
致在进行样品分析时候出现检测到很少或者没有检测到微球的情况。试验管在上流式细胞仪检测前需
要振荡混合3-5秒钟，这样在FL3/FL4通道能够更好的分辨出检测不同细胞因子的微球。
CBA操作实验中，哪些步骤需要避光进行？为什么？
凡涉及检测抗体的相关步骤都需避光操作。这是由于CBA技术是使用PE（藻红蛋白）检测样品的荧
光信号。由于使用藻红蛋白报告系统，可使得CBA达到最佳敏感度的分析效果，因此每步添加了检测试剂后都要避光反应。此外，在加入检测试剂时，除了需避光操作外，还需严格遵守试剂盒的要求规
范操作（比如：精确的加液），因为添加的微球数量不准确会改变有效捕获面积从而影响检测的敏感性。
我看不到FL2荧光信号或者看到的FL2荧光信号很弱，怎样解决这个问题？
检查样品的稀释度，不要随意的更改要求的孵育时间，在孵育过程中，保护样品试剂管不受到光照。
为什么实验结果背景很强或者全部样品都显示高度的阳性？
实验结果背景很强可能是因为样品的浓度太高。请对您的样品，尤其是首次进行检测的体系，进行不
同稀释度的检测。如果所有样品都显示阳性或者高于标准品的最高浓度读数，表明样本中待测蛋白的
含量超出CBA的正常检测范围，需要对样品进行进一步的稀释。
为什么在实验中会出现碎片过多和没有看到微球的情况？
如果在样品分析的时候在FSC/SSC的检测图中出现碎片，上调SSC的阈值或者同时上调FSC和SSC的
双阈值。如果在调整SSC的阈值以后问题依然存在，请重复样品的洗涤步骤或者再次稀释样品。
FL4直方图中，有其中一种微球荧光度值很低，为什么？
某一种微球FL4荧光值较低说明此种微球数量较少。需要操作者在实验之前，将每种微球充分的涡旋
混合。
样本中几乎检测不到蛋白，为什么？
样本稀释浓度可能过低。尝试不同稀释浓度的样本。选取合适的样本或合适时间点的样本。
获取时微球的FL4通道荧光有重叠，为什么？
某些含有非常高浓度细胞因子的样本可能发生此种情况。样本上机检测之前确保用setup微球优化仪
器条件。
标准曲线不理想，原因是什么？
1)CBA试剂盒中所提供的标准样品是蛋白冻干粉，由于大部份的标准样品属细胞因子类的敏感型蛋
白，在重悬标准样品成溶液或进行标准样品稀释时，不可采用振动混匀及剧烈吹打的方式处理标准样品，只需放于室温下平衡15 分钟即可。在进行标准样品的系列稀释时，只需轻轻吹打样品数次即可。否则，由于制成溶液后的标准样品不稳定，经剧烈混匀后易降解失活，影响实验中标准曲线的拟制；
2)不管是标准品储备液 (x10)或实验中的稀释液中，标准品在配成溶液后不稳定，在配制成储备液
(x10) 的12小时后将不能再使用。在每次实验前都要重新配置新的标准品溶液；
3)在加入检测试剂时，需严格遵守试剂盒的要求规范操作（比如：精确的加液），因为添加的微球
数量不准确会改变有效捕获面积, 从而影响检测的敏感性和准确性。
分析时不能自动读取数据的MFI，为什么？
1)FSC/SSC中碎片太多. 应注意维护仪器正常状态, FACSComp Lyse/No Wash Pass；
2)FL3和/或FL4分辨率差, 不能区分不同微球. 应注意维护仪器正常状态, FACSComp Lyse/No Wash
Pass.
标准品和/或样本MFI过低的原因是什么？
1)反应温度低；
2)反应时间短；
3)样本过度稀释；
4)操作过程中未避光；
CBA的检测结果是否可直接与ELISA的分析结果进行对比?
不可以。因为CBA是基于荧光的报告系统实现的，虽然CBA系统相对于ELISA分析具有良好的优势，能够提供更高的敏感性和更大的浓度检测范围。但是两者得出的实验数据绝对值不能够直接比较，而对于不同样本中细胞因子含量增加或降低的趋势是有可比性的（已经证实因子浓度趋势改变吻合度超过90%）。
在血清和血浆中，CBA试剂盒所能够检测到的最低浓度是多少？
我们不建议研究者根据标准曲线外推低于标准曲线最低值的实验报告数值。这样的外推操作会增加结果的数学统计学上的变化程度和导致标准差值的增大。最理想的情况是我们做标准曲线的时候增加额外的稀释浓度点（比如10, 5, 2.5, 1.25 pg/ml）。当一些蛋白相对于背景(0 pg/ml)没有信号的情况下，我们就可以在最后的样品分析中把这种蛋白排除掉。在常规的免疫分析中，血清和血浆中的一些细胞因子的含量低于检测的最低值以至于不能被检测到。这是因为绝大部分的细胞因子在具有特殊的免疫

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