DOI:10.13995/jki.11-1802/ts.026661
引用格式：王浩，黄丹，余东，等.扣囊复膜酵母菌对固态混菌发酵体系微生物菌结构及代谢的影响[J].食品与发酵工业,2021,
47(11):45-52.WANG Hao,HUANG Dan,YU Dong,et al.Effect of Saccharomycopsis fibuligera on the microbial community structure and metabolism in mixed solid fermentation system[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(11):45-52.
扣囊复膜酵母菌对固态混菌发酵体系微生物菌结构及代谢的影响
王浩1，黄丹1,2，余东3，郭辉祥3，邹永芳3，罗惠波1,2∗
1(四川轻化工大学生物工程学院，四川自贡,643000)
2(酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡,643000)3(舍得酒业股份有限公司，四川遂宁,629209)摘㊀要㊀从浓香型大曲中分离1株扣囊复膜酵母菌，在混菌固态发酵条件下研究其对微生物结构及代谢物的影响㊂基于混菌固态发酵体系，在发酵温度/湿度分别为25ħ/95%㊁28ħ/90%㊁35ħ/85%㊁38ħ/80%㊁43ħ/75%的条件下接种扣囊复膜酵母菌，分析其对混菌发酵体系微生物多样性㊁理化参数㊁酶活力㊁挥发性代谢物的影响㊂结果表明，在不同的发酵条件下扣囊复膜酵母菌的扰动会导致固态混菌
培养体系中微生物物种丰富度降低，毕赤酵母属(Pichia)㊁横梗霉属(Lichtheimia)㊁肠杆菌属(Enterobacter)的相对丰度降低，芽孢杆菌属(Bacil-lus)㊁复膜酵母属(Saccharomycopsis)相对丰度增多㊂25ħ/95%发酵条件下还原糖含量㊁糖化力㊁液化力㊁发酵力㊁酒化力有所提高,28ħ/90%发酵条件下实验组的还原糖含量㊁糖化力㊁发酵力有明显增加，液化力在所有发酵条件下都有增强㊂35ħ/85%㊁42ħ/75%发酵条件下吡嗪类化合物显著增多,25ħ/95%㊁38ħ/80%发酵条件下醇类化合物增多,25ħ/95%㊁35ħ/85%发酵条件下酯类化合物增多㊂可见接种扣囊复膜酵母菌会对固态混菌体系中其他的微生物造成扰动进而影响体系中的微生物代谢㊂
关键词㊀扣囊复膜酵母；固态混菌发酵；挥发性代谢物；微生物类相互作用；发酵特性
第一作者：硕士研究生(罗惠波教授为通讯作者,E-mail:1036884458@qq)
㊀㊀基金项目：四川省科技厅重点研发项目(2019YFS0518)；中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室开放基金项目(2019zd035)
收稿日期:2021-01-07，改回日期:2021-02-20
㊀㊀扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera )又称拟内孢霉，属于子囊菌门(Ascmycota)酵母亚门(Sac-
charomycotina)下酵母纲(Saccharomycetes )酵母目(Saccharomycetales)酵母科(Saccharomycetaceae)复膜酵母属(Saccharomycopsis )，常被发现于具有淀粉质的底物中，由于该酵母为多极芽接和菌丝体形成繁殖而被认为是一种食源性的双态性真菌[1]㊂在汾酒大曲[2]㊁红曲[3]㊁浓香型白酒大曲[4]㊁小曲酒曲药[5]㊁酱香型大曲[6]以及发酵前期的酒醅[7-8]等各种酒曲中均有扣囊复膜酵母的存在㊂周森等[8-9]采用传统分离方法结合高通量测序对11份清香大曲微生物进行系统研究，在真菌组成中，扣囊复膜酵母是11份大曲样品的主要真菌，其数量远高于丝状真菌和其他酵母菌，占大曲样品的51.48%~98.32%；马凯等[10]在汾酒大曲堆中随机从上㊁中㊁下取3份大曲样品，分离出81株真菌并进行了基于ITS 基因序列的分子生物学鉴定，结果表明在汾酒大曲中分布的酵母菌中，扣囊复膜酵母是优势酵母菌种㊂然而，扣囊复膜酵母在混菌发酵体系中的作用却鲜有报道㊂
浓香型大曲生产具有自然接种混菌固态发酵的特点，其微生物来自于粮食原料及环境，而浓香型大曲主要原料是小麦[11]㊂微生物的生长代谢受温度㊁
湿度㊁pH 值等环境条件影响，还与大曲微生物之间的相互作用有关[12]㊂浓香型大曲发酵过程中发现存在扣囊复膜酵母[13]㊂本研究将从浓香型大曲中分离获得的扣囊复膜酵母接种于小麦培养基中，空白组为对照，以浓香型大曲制曲过程中重要环境参数温度㊁湿度变化为依据，设置发酵条件进行生料发酵㊂通过研究不同发酵条件下多菌共酵体系中扣囊复膜酵母对微生物多样性㊁发酵醅理化参数及重要酶活力㊁挥发性风味物质等代谢产物的影响，分析扣囊复膜酵母对微生物菌的扰动作用，为扣囊复
膜酵母的强化应用及挥发性风味代谢物的解析提供基础数据㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀材料与试剂
小麦，市售的软质小麦；扣囊复膜酵母菌株，分离自浓香型大曲;Na 2EDTA㊁Na 2HPO 4㊁NaH 2PO 4㊁蜗牛酶㊁溶菌酶㊁十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trime-
thyl ammonium bromide,CTAB)㊁十二烷基硫酸钠(so-dium dodecyl sulfate,SDS)，生工生物工程(上海)股份有限公司；异丙醇，天津市津东天正精细化学试剂厂；，成都市科隆化学品有限公司;Tris-平衡酚(pH>7.8)㊁酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(yeast extract peptone dextrose medium,YPD)(生化试剂)，上海博威生物医药有限公司㊂
1.2㊀仪器与设备
萃取头(50/30μm DVB/CAR on PDMS)，上海安谱实验科技股份有限公司;Agligent7890A 5975B 型气相谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司㊂trime
1.3㊀实验方法
1.3.1㊀固态发酵培养基的制作
所有固态培养基使用同一批小麦，用80ħ水润粮4h，润粮时翻拌均匀，使小麦充分吸收水分；然后进行粉碎加水搅拌，小麦粉碎要烂皮不烂心，粗细比4ʒ1，分别将小麦粉分装在陶瓷托盘中，补充水分使加水量为总质量的30%，最后用8层纱布封住陶瓷托盘㊂
1.3.2㊀扣囊复膜酵母菌菌株对微生物菌的扰动实验
分别设定发酵温度/湿度为25ħ/95%㊁28ħ/ 90%㊁35ħ/85%㊁38ħ/80%㊁43ħ/75%，每个条件下设2个空白组和2个实验组㊂实验组加入从浓香型大曲中分离到的扣囊复膜酵母菌㊂实验所取温度和湿度是根据浓香型大曲在曲房中生产过程及扣囊复膜酵母菌的最高耐受条件设定㊂所分离的扣囊复膜酵母菌所生长的原始环境为大曲，浓香型大曲的最初发酵温度/湿度分别为25ħ/95%，所以开始发酵培养条件为25ħ/95%，而在分离实验时，大曲培养条件为43ħ/75%时没有分离到这个菌，表明此条件下扣囊复膜酵母在大曲中已经没有或极少，所以结合大曲生长环境选取5个发酵条件㊂作图分析时对应上述发酵条件将空白组标记为KJa0㊁KJB0㊁KJc0㊁KJd0㊁KJe0，实验组标记为KJa1㊁KJB1㊁KJc1㊁KJd1㊁KJe1㊂
1.3.3㊀固态发酵物中微生物总DNA的提取
采用文献报道的方法提取固态发酵物中微生物总基因组DNA[14]㊂16S扩增子测序使用338F(5ᶄ-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3ᶄ)和806R(5ᶄ-GGAC-TACHVGGGTWTCTAAT-3ᶄ)引物对V3~V4可变区进行PCR扩增㊂ITS扩增子测序使用ITS1F(5ᶄ-CTT-GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3ᶄ)和ITS2R(5ᶄ-GC-TGCGTTCTTCATCGATGC-3ᶄ)对ITS区进行扩增㊂1.3.4㊀理化及酶活检测
水分㊁pH㊁酸度㊁液化力㊁糖化力㊁发酵力㊁酒化力的测定参照QB/T4257 2011‘酿酒大曲通用分析方法“，还原糖含量的测定参考GB5009.7 2016‘食品安全国家标准食品中还原糖的测定“㊂
1.3.5㊀挥发性物质的测定
采用GC-MS对样品进行测定㊂挥发性化合物的测定在20mL顶空瓶中加入2g大曲样品㊁饱和食盐水㊂加入20μL0.02264mg/mL乙酸正戊酯为内标㊂平衡温度和萃取温度为60ħ，平衡10min，萃取50min，解析3.5min㊂仪器条件：谱条件:DB-WAX 毛细管谱柱(60mˑ0.25mm,0.25μm)；载气：氦气(He)；流量:1mL/min，不分流，进样口温度250ħ；柱温：起始温度40ħ保持1min，以5ħ/min升温至180ħ保持5min，再以8ħ/min升温至230ħ保持10min，运行时间50.25min㊂质谱条件：接口温度250ħ，离子源温度230ħ，电离方式为电子电离源，电子能量70eV，四级杆温度150ħ，传输线温度290ħ，扫描质量范围20~550amu㊂
1.3.6㊀生物信息学与统计分析
生物信息分析流程使用QIIME2推荐的DADA2方法来去噪去嵌合，为了方便理解，仍以OTU代表这个扩增特征的代表序列㊂进化树的绘制由R语言ggtree包完成㊂选取关注的OTU代表序列进行系统进化分析(每个属选取一个丰度最高的OTU作为代表，之后再选取丰度最高的前50个属)绘制进化关系树图，同时结合OTU在各个分组的绝对丰度进行热图可视化展示㊂RDA的分析主要依赖R语言VEGAN包，以及用ggplot2进行可视化㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀扣囊复膜酵母菌对多菌共酵体系微生物落多样性的影响
2.1.1㊀样本微生物落测序深度评价
如图1所示，通过观察物种的Shannon稀释曲线都趋于饱和，这表明测序数据足以评估微生物生态系统的微生物落㊂
2.1.2㊀不同发酵条件下扣囊复膜酵母菌对微生物菌多样性的影响
采用高通量测序技术对小麦固态多菌种固态发酵体系进行研究，得到空白组和实验组中微生物落情况，并分别计算Shannon㊁Faith s Phylogenetic Di-versity及Chao1指数来评估微生物落的丰富度和
a-细菌;b-真菌
图1㊀样品稀释曲线
Fig.1㊀Rarefaction curves of OTUs for all samples
多样性，如表1所示㊂空白组的Chao1㊁Faith s Phylo-
genetic Diversity指数数据明显低于实验组且Shannon
指数数值大部分高于实验组，结合分析发现接种扣囊
复膜酵母菌后，小麦多菌种发酵体系中物种丰富度明
显降低且均匀度变低㊂表明实验组接种扣囊复膜酵
母菌后对小麦多菌种发酵体系中的微生物发生了明
显的扰动㊂
表1㊀Alpha多样性指数
Table1㊀Alpha diversity index
样品
Chao1Shannon Faith_pd 真菌细菌真菌细菌真菌细菌
KJa022.500085.50002.09222.90441.1905  3.0239 KJa1  2.000056.00000.00342.11290.6814  2.1971 KJb020.500059.00001.52353.06471.0740  2.0986 KJb124.500050.00001.71342.87091.1591  1.8480 KJc019.000068.50002.36902.85801.0459  1.9678 KJc1  3.000056.50000.00472.77340.7883  1.8659 KJd018.000039.00000.33652.82030.8951  1.8112 KJd18.500016.50000.15800.68550.8236  1.3328 KJe019.000044.00001.51282.95201.5537  1.6991 KJe118.000011.50002.16520.37731.06760.9158
2.2㊀扣囊复膜酵母菌对多菌共酵体系微生物落组成的影响
如图2所示，空白组与实验组菌种中优势微生物组成大致相同，丰度前20的菌种都占微生物总量的98%左右㊂但相对丰度占比情况发生了明显变化，实验组与空白组相比毕赤酵母属(Pichia)㊁横梗霉属(Lichtheimia)㊁肠杆菌属(Enterobacter)㊁片球菌属(Pediococcus)㊁魏斯氏菌(Weissella)相对丰度占比明显降低，分别减低了9%㊁18%㊁17%㊁8%㊁1%，复膜酵母属(Saccharomycopsis)㊁芽孢杆菌属(Bacillus)相对丰度占比明显增多，分别增多了45%㊁44%㊂值得注意的是，实验组中复膜酵母属也并非在所有发酵条件下都增加，只有在25ħ/95%㊁35ħ/85%㊁43ħ/ 75%这3个发酵条件下所在的复膜酵
母属有明显增加，而在28ħ/90%㊁38ħ/80%的发酵条件下的复膜酵母属有明显降低的情况㊂且在28ħ/90%发酵条件下，多菌种共发酵体系中未分类的曲霉菌属
(Unspecified_Aspergillaceae)有增加了48.24%，与毕赤酵母属共占比88.40%；在38ħ/80%发酵条件下，多菌种共发酵体系中毕赤酵母属独占99%㊂将其微生物丰度变化情况进行主成分分析(principal component analysis,PCA)，如图2-c所示，可以观察到实验组和空白组微生物组成有明显变化，解释度PCA1+PCA2达到81.29%㊂
2.3㊀扣囊复膜酵母对固态混菌培养基微生物菌相互作用的影响
对小麦多菌种共发酵体系中微生物落进行分析，空白组和实验组有明显的差异㊂为了进一步探讨接种扣囊复膜酵母是否影响物种间的相互作用，构建空白组和实验组微生物落的相关网络㊂分别选取其中相对丰度前10的细菌和真菌，如图3所示㊂在实验组中芽孢杆菌属(Bacillus)与其他微生物产生了显著负相关性，而在空白组中芽孢杆菌属并没有此特性㊂在空白组中毕赤酵母属(Pichia)与未分类曲霉菌属(Unspecified_Aspergillaceae)㊁未分类格孢腔菌属(Unspecified_Pleosporales)㊁根霉属(Rhizopus)呈现显著负相关性，而实验组中与复膜酵母属(Saccharomy-copsis)呈现显著负相关性㊂而假丝酵母属(Candida_ Lodderomyces_clade)与片球菌属(Pediococcus)在空白组中呈显著负相关性在实验组中则呈现显著正相关性，且与魏斯氏菌属(Weissella)产生新的显著正相关性㊂结果表明，空白
组和实验组多菌种共发酵体系中微生物落的整体网络结构发生了明显的变化㊂表明扣囊复膜酵母对固态混菌培养基微生物菌发生了扰动作用，改变了多菌种共发酵体系中微生物落的整体网络结构㊂
a-真菌;b-细菌;c-PCA
图
2㊀属水平的物种相对丰度
Fig.2㊀Relative abundances of microbial community at genus level
a-空白组固态发酵体系的微生物相关性;b-实验组固态发酵体系的微生物相关性
图3㊀固态混菌培养体系中微生物的相关性网络
Fig.3㊀Co-occurrence networks of microbial communities in mixed solid fermentation system
注：关联表示统计上显著(P <0.05)
2.4㊀不同发酵条件下扣囊复膜酵母菌对微生物菌生长代谢的影响
2.4.1㊀不同发酵条件下扣囊复膜酵母菌多菌共酵体系理化指标的影响不同发酵条件下小麦多菌种共发酵体系的理化
指标如图4所示，可以看出空白组和实验组的理化指标变化趋势大致是相同的，说明接种扣囊复膜酵母菌后依然遵守设定的环境对发酵体系的约束㊂但接种扣囊复膜酵母菌后测定的理化在各发酵条件下变化情况是不同的㊂分析小麦多菌种共发酵体系中的理
化变化情况可知，实验组与空白组水分变化情况大致相同，都是随温度升高湿度减低而降低㊂pH 变化情况除38ħ/80%发酵条件下实验组明显高于空白组㊂酸度变化情况是在28ħ/90%㊁35ħ/85%㊁43ħ/
75%发酵条件下实验组比空白组明显降低㊂结合上述对微生物落的分析，产酸相关的菌属片球菌属(Pediococcus
)㊁魏斯氏菌(Weissella )㊁乳球菌属(Lacto-
coccus )等实验组明显低于空白组㊂实验组pH 和酸度的变化应是扣囊复膜酵母的接种导致产酸微生物减少的结果㊂
图4㊀不同发酵条件下混菌体系中水分㊁pH 和酸度的变化
Fig.4㊀The changes of water,pH and acidity in mixed solid fermentation system under different fermentation conditions
2.4.2㊀不同发酵条件下扣囊复膜酵母菌对微生物菌产酶能力的影响
不同发酵条件下小麦多菌种共发酵体系的酶活力如图5所示，实验组与空白组对比，还原糖和糖化力变化情况基本一致㊂在35ħ/85%㊁43ħ/75%发酵条件下有所降低，在25ħ/95%㊁28ħ/90%㊁38ħ/80%这3个发酵条件下皆有所升高；液化力在所
有发酵条件下都高于空白组㊂发酵力在25ħ/95%㊁
28ħ/90%㊁35ħ/85%这3个发酵条件下实验组高于空白组㊂而酒化力影响情况并不明显㊂但液化力
在所有发酵条件下实验组都优于空白组㊂已有的研究表明扣囊复膜酵母有较强的产淀粉水解酶的能力[15]，接种后对固态混菌培养基中的酶活力在低温(38ħ之前)发酵条件有一定影响㊂但对实验组和空白组整体分析影响并不显著㊂
图5㊀不同发酵条件下混菌体系中还原糖含量㊁糖化力㊁液化力㊁发酵力㊁酒化力的变化
Fig.5㊀The changes of reducing sugar content,saccharifying power,liquefying power,fermenting power and liquor-producing
power in mixed solid fermentation system under different fermentation conditions
2.4.3㊀扣囊复膜酵母对微生物菌合成挥发性代谢物的影响
将测定的挥发性化合物与各发酵条件相关性分析并使用正交最小二乘法分析其主成分分析及差异代谢物，如图6所示㊂通过GC-MS 检测获得的不同发酵条件下微生物菌的挥发性代谢物可知，醇类是
含量最多的挥发性代谢物，其余依次是酯类㊁吡嗪类㊁
酸类㊁醛类化合物㊂通过分析实验结果可知，在25ħ/95%发酵条件下实验组与酯类有明显正相关,35ħ/85%发酵条件下实验组与吡嗪类化合物呈现明显正相关㊂且通过分析挥发性代谢物物组成,35ħ/85%㊁42ħ/75%这2个发酵条件下，实验组的吡嗪类化合物明显增多，分别是空白组的5.7和2.3倍㊂
相对应的发酵条件下微生物落的变化中芽孢杆菌

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