摘要：口蹄疫是我国比较多发的一类动物疫病，口蹄疫的检测诊断是做好口蹄疫防控工作的关键。为了更好更快地检测和诊断口蹄疫，本研究在口蹄疫血清3ABC 检测阳性的基础上尝试建立一种快速灵敏的PCR 检测技术。通过查询基因序列、引物设计、引物合成、PCR 反应条件摸索和优化、PCR 扩增、凝胶电泳成像，最终在待测样品中成功地扩增出A 型口蹄疫病毒预期大小的条带，可以快速检测出A 型口蹄疫病毒。O 型和Asia I 型因没有阳性病原学样品或标准毒株，未能扩增出相应的目的条带。
关键词：口蹄疫；检测技术；聚合酶链式反应（PCR ）
口蹄疫PCR 检测技术的建立
张红梅1，王雅媛2,3，曹文琴1，白崇生1*，权富生3*
（1.榆林市畜牧兽医服务中心陕西榆林719000；2.榆林市农业宣传信息中心陕西榆林719000；
3.西北农林科技大学陕西杨凌712100）
doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2023.08.003
收稿日期：2022-12-10
作者简介：张红梅（1981.7—），女，陕西榆阳人，本科，兽医师，主要从事畜牧兽医相关工作。
*通信作者
口蹄疫（foot-and-mouth disease ，FMD ）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV ）引起的一种急性、烈性、水泡性病毒传染病，主要感染牛、羊、猪等70多种偶蹄科动物，典型的临床特征主要表现为机体发热，口腔黏膜、唇部、蹄部及乳房皮肤出现烂斑或水疱性病理变化
[1-3]
。
FMD 被世界动物卫生组织（WOAH ）和联合国粮农组织
（FAO ）列为A 类传染病的首位。我国亦将FMD 排在动物疫病病种名录的第一位[4]
。FMD 的诊断技术从大的方面分为临床诊断和实验室诊断。单纯的临床诊断不能作为FMD 确诊的依据[5]。目前，检测技术方法虽然层出不穷，但是，由于FMD 血清型种类繁多和FMDV 很容易发生变异，给本病诊断带来一定困难。目前国内外有不少实验室应用PCR 技术进行FMD 的诊断和检测。PCR 技术因其高度的敏感性、特异性，已得到越来越多
的重视和应用。本研究借助现代分子生物学技术，尝试
建立一种快速灵敏的FMDV PCR 检测技术，通过引物设计、PCR 反应条件摸索、产物分析等，成功建立了A 型FMD 的PCR 快速诊断技术，为榆林市FMD 的防控提供了有力的技术支撑。
1试验材料
1.1试剂
（表1）1.2仪器（表2）1.3病毒样本
从榆林市12个县市区的疫病监测样品中随机选取了FMD 血
清学阳性样品8份，其中，牛血清3份，标号分别为B1、B6、B39；羊血清5份，标号分别为C34、C40、C42、C43、C74。
2研究方法
2.1引物设计与合成
在NCBI 上下载11条A 型FMDV 基因全序列、6条O 型
FMDV 基因全序列、6条Asia I 型FMDV 基因全序列，分别用Me -gAlign 软件进行基因序列同源性比对，选择保守区域分型设计引物，引物合成由专业公司支持完成。引物信息见表3。
2.2口蹄疫病毒RNA 提取
将水浴锅水温调至56℃保温，头、EP 管灭菌备用，使用制冰
机制冰备用。严格按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extrac -
tion Kit Ver.5.0试剂盒说明书进行操作。
2.3反转录
1）在Microtube 管中加入1μL Random primers 与模板RNA
5μL 在70℃恒温金属浴中保温10min 后迅速转入冰上冷却两分
Reverse Transcriptase M-MLV
2641A 宝生物工程(大连)有限公司5X Reverse Transcriptase M-MLV Buffer
2641A 宝生物工程(大连)有限公司DNA Marker DL 20003427A
宝生物工程(大连)有限公司TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒
join和in哪个查询更快
宝生物工程(大连)有限公司无水乙醇天津市瑞金特化学品有限公司
表1 试剂清单
立式压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-50 G 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司
电热恒温鼓风干燥箱
PH G-9203A 上海精宏试验设备有限公司容声冰箱BCD-209S1E
广东省顺德珠江冰箱厂
凝胶成像仪BIo-RAD Laboratories-segrate
数显恒温水浴锅
HH-6金坛市科析仪器有限公司
制冰机AF 100Scotsman
超净工作台北京东联哈尔仪器制造有限公司微波炉D700TL23-K5格兰仕微波炉电器有限公司
电泳仪DYCP-3DN
北京市六一仪器厂
梯度PCR 仪T100
Bio-RAD
电子天平
JB/T5374-1991
梅特勒-托利多仪器有限公司
烧杯、酒精灯、EP 管、
移液等
表2 仪器清单
钟以上，再离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube 管底部。
2）在上述的Microtube 管中配制下列反转录反应液。
上述模板RNA/引物变性溶液6μL 5×M-MLV Buffer 2μL
dNTP Mixture 0.5μL
RNase Inhibitor
0.5μL
RTase M-MLV
0.5μL
RNase free dH 2O
补充至10μL
3）42℃保温1h 4）70℃保温15min 后冰上冷却，得到的cDNA 溶液可直接用于PCR 扩增。
2.4PCR 扩增
反应体系为20μL （无菌水6μL 、Taq 酶10μL 、上游引物
1μL 、下游引物1μL 、模板DNA 2μL ）。根据合成引物的参考退火
温度进行梯度PCR 反应条件摸索和优化后，扩增反应程序如下：预
变性94℃，5min ；变性94℃，30s ；退火37.5℃，30s ；延伸72℃45s ；重复“变性、退火、延伸”步骤达32个循环；最后72℃，5min ；4℃保存。
2.5产物检测
PCR 反应结束，琼脂糖凝胶电泳-EB 替代物染制胶块，取
10μL 扩增产物加样于1%琼脂糖凝胶孔内，以分子量为2000bp
的Maker （含6条参考条带，大小分别为100bp 、250bp 、500bp 、750bp 、1000bp 、2000bp ）作为参照物，在120V 的电压下电泳
30min ，用凝胶成像仪观察PCR 产物在凝胶中的位置。
3研究结果
3.1A 型、O 型、Asia I 型反应结果
第一列为DNA Maker ，从第二列开始从左往右依次编号为1~6，
其中1、2、3三个孔所加样品为C34；4、5、6三个孔所加样品为C43；1、4孔所加引物为Asia I 型FMDV 引物；2、6孔所加引物为O 型
FMDV 引物；3、5孔所加引物为A 型FMDV 引物。结果如图1所示。由建立的反应体系检测可以看出，3和5泳道可以看到很明显的A 型FMDV PCR 条带，与预期大小相同，为553bp 。而1和
4泳道以及2和6泳道看不到明显的PCR 反应条带。
3.2A 型反应结果
加样孔样品编号从左往右依次为C34、C43、B1、B6、C74、C40、
C42、B39，各孔所加样品均为已知FMD 检测的血清样品。PCR 产物电泳结果显示有A 型FMDV 对应的条带出现，条带大小为553bp ，
而O 型和Asia I 型没有出现相应的条带。结果如图2所示。
4分析讨论
FMD 发病快、传染性极强，及时准确的诊断才能有效防制
FMD [6]。目前常规检测口蹄疫的技术主要有动物接种、病毒分离和
血清学试验等方法，这些方法要求比较高，例如有的试验需要的样品是发病动物的新鲜水泡液或者水泡皮，采集样品不方便[7]。这些方法中动物接种试验需要几天到几周的时间周期太长、血清中和
试验需细胞培养耗时较长、荧光抗体试验存在着非特异性反应和敏感性低等缺点。这些方法难于满足实际的检测需求。
FMDV 除常见的7个血清型外，还有80多个亚型，亚型基因组
差异较大，A 、O 、Asia I 三种血清型的RNA 序列同源性较高，经过检测可以达到60%~70%。编码结构蛋白的Pl 区比编码非结构蛋白的其它区域差异更大[8]。设计分型引物需要在VP1序列内，但是VP1片段在同一血清型的FMDV 中差异也比较大，这就增加引物设计的难度，引物设计时考虑特异性的同时还要考虑到检出率。本研究在充分比较同源性的基础上，在血清型之间同源性低，血清型内同源性高的基因区段设计引物。经过筛选和调整，选取VP1基因区段设计引物，使引物具有更高的特异性和检出率。
802bp 表3 引物信息图1A 型、O 型、Asia I 型反应PCR 产物电泳检测结果
图2不同样品A 型FMDV PCR 检测结果
（下转第104页）
在我国境内曾发现和流行的FMDV 基因型主要有A 型、O 型、Asia I 型三种，其他基因型至今尚未被检测出[9]。国内有些研究者建
立的多重PCR 检测技术，可以将7种基因型的FMDV 一次性分型
检测出[10]
。但是存在不足之处，一方面引物设计很复杂难度较大，避免7个血清型的病毒之间的交叉免疫，另一方面经过多年来FMD 病原学监测发现，目前国内主要感染A 型、O 型两种基因型FMDV ，Asia I 型FMD 经过多年来的综合防控，已成功退出了动物
强制免疫，实现了从免疫无疫到非免疫无疫的转变，实施以监测扑
杀为主的综合防控措施，因此，7型多重PCR 检测技术已经不符合国内的实际需求。不论从当前我国依然存在的A 型、O 型FMD 的实验室诊断角度出发，还是从Asia I 型的非免疫无疫状态的监测角度出发，FMD 的分子生物学快速检测技术都具有明显的实践应用意义。本实验建立的PCR 快速检测技术是针对国内实际情况和实际需求而建立的，相对比较简单容易实施。
利用优化的反应条件进行PCR 反应，出现A 型引物扩增产物并且符合引物设计预期片段大小，而O 型和Asia I 型FMDV 引物并没有扩增出相应的片段。针对上述情况综合分析，可能是由于一方面采集样品的患病动物仅感染了A 型FMDV ；另一方面由于我们没有O 型和Asia I 型的标准毒株样品，不能确定本次试验建立的O 型和Asia I 型FMDV PCR 检测方法是否切实可行，对于该试验所建立的O 型和Asia I 型FMDV PCR 检测方法还有待下一步的
研究中引入已知的阳性样品或标准毒株进行进一步的试验验证。
5结论
本研究在待测样品中成功地扩增出A 型FMDV 预期大小条
带，而O 型和Asia I 型未扩增出相应的目的条带。本研究所建立的FMDV PCR 检测方法具有特异性和敏感性，可以快速检测出A 型FMDV 。■
参考文献：[1]
Esteban Domingo,Eric Baranowski,Cristina Escarm ís ,et al.Foot-and-mouth
disease virus [J].Comparative Immunology,Microbiology and Infectious Diseases,2002,25(5):297-308.
[2]
Jamal M,Belsham Graham J.Foot-and-mouth disease:past,present and fu-ture [J].Veterinary Research,2013(44):116.
[3]Yoon H,Yoon S S,Wee S H,et al.Clinical manifestations of foot-and-mouth disease during the 2010/2011epidemic in the Republic of Korea [J].Transboundary and Emerging Diseases,2012,59(6):517-525.[4]王鑫.陕西省渭南地区猪口蹄疫流行病学调查[D].西北农林科技大学,2010.
[5]林密.口蹄疫等动物疫病诊断技术研究进展[J].兽医导刊,2018(15):
8-11.
[6]薛先明.猪口蹄疫的诊断及其综合防控[J].当代畜牧,2015(17):67-68.[7]周卓灿.牛口蹄疫免疫效果评估[D].湖南农业大学,2016.
[8]刘亚丽.南非型口蹄疫病毒常规RT-PCR 检测方法的建立[D].中国农业
科学院,2016.
[9]陈冬冬.口蹄疫病毒VP3定点突变体的构建及其生物学特性和免疫血
清学研究[D].中国农业科学院,2018.
[10]邱杨，肖性龙，赵丽，等.多重荧光RT-PCR 同时检测口蹄疫O A Asia Ⅰ三
种血清型[J].中国兽医杂志,2010,46(06):9-11.
（上接第006页）
疫荧光法检查病毒液的盖玻片培养物，呈现猪细小病毒特异性荧光。病毒液的病毒含量（TCID 50）可达到107.0。免疫电镜检查，可在细胞核内观察到外观呈六角形或圆形，无囊膜，直径约为20nm 的病毒粒子，以PCR 检查含毒细胞培养液，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，出现一条445bp 的特异性电泳条带，并与7909株相符。对分离病毒进行了VP2基因克隆和测序，结果分离病毒与其他猪细小病毒毒株的VP2基因片段的核苷酸同源性均在99%以上，氨基酸同源性在98%以上。该分离病毒能被猪细小病毒特异性抗血清所中和。经过上述一系列的试验，证明分离毒株为猪细小病毒。分离毒株与其他几株猪细小病毒VP2的进化树分析表明，分离毒株与NADL-2株和China 株的遗传距离最近。分离病毒经过检测表明，
病毒耐热，80℃作用5min ，病毒失活和丧失血凝活性。70℃作用2h ，其血凝价及TCID 50有所下降。
对胰蛋白酶有抵抗力。其对酯溶剂氯仿和乙醚不敏感。病毒在pH 3~9，稳定，血凝价和病毒含量不下降。这些理化特性与资料中[8]记载的相同。
5结论
2020年从黑龙江省某猪场的流产仔猪病料中，经猪肾原代细
胞培养，分离出一株病毒，该毒株具有CPE 作用，能凝集豚鼠红细胞；分离毒株盖玻片培养物，经猪细小病毒荧光抗体染，呈现猪细小病毒特异性荧光；于电镜下观察，可见外观呈六角形或圆形、无囊膜、直径20nm 左右的病毒粒子，利用针对猪细小病毒VP2基因的引物，应用PCR 方法进行检验，特异性片段大小为445bp ，并与国
家标准株7909株扩增产物具有相应的电泳条带；对其进行了VP2基因克隆和测序，序列分析表明，H 株VP2基因片段与其它PPV 毒株的VP2基因片段的核苷酸同源性均在99%以上，氨基酸同源性在98%以上。其与NADL-2株及China 株的亲缘关系最近。另外，分离的H 株病毒能被7909株猪细小病毒特异抗血清中和。分离的H 株猪细小病毒的红细胞凝集（HA ）效价≥1:256，病毒含量为≥107TCID 50。病毒纯净、无细菌、霉菌及支原体污染。病毒耐热，在70℃作用2h ，病毒滴度下降，80℃作用5min ，病毒失活。对胰蛋白酶有很强抵抗力。对乙醚、氯仿不敏感。耐酸范围大，pH 3~9，经90min 作用仍稳定。该分离毒株具有良好的生物学及血清学特性。■
参考文献：[1]Johnson R H,Donaldson-Wood C R,Joo H S,et al.Observations on the
epidemiology of porcine parvovirus [J].Aust Vet 1976,52:80-84.
[2]Mengeling W L.Pocine parvovirus infection in:Leman A P,Glock R D,et al.Diseaseof swine [M].5th edn Iowa state university press,1981:325-365.[3]潘雪珠，叶向阳，严仲烈，等.猪细小病毒s-1毒株的分离和鉴定[J].上海畜牧兽医通讯,1983(1):1-3.
[4]侯世宽，江曙光，孙恩贵.猪细小病毒Ma-1株的分离和鉴定[J].兽医大学学报，1983，23(4):321-328.
[5]李宝启，金岳，王润之，等.猪细小病毒的分离与鉴定[J].家畜传染病,1985(3):17-20.
[6]杨卉新，田玉民.猪细小病毒的分型、遗传进化及流行病学研究进展[J].现代畜牧兽医，2015(11):44-49.
[7]孙爱红，刁清强，殷庆祥.猪细小病毒病防治措施[J].兽医临床科学,2020(2):91-92.
[8]
费恩阁，李德昌，丁壮.动物疫病学[M].中国农业出版社,2004:274.

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。